一,、背景

大鼠氣管上皮細胞是一種在實驗室研究中常用的細胞類型,。這些細胞通常來自大鼠的氣管組織，并被培養(yǎng)在實驗室中以研究各種生理和病理過程,。

在近端下呼吸道的上皮表面,，主要是纖毛上皮細胞，它與基底細胞及杯狀細胞一起構(gòu)成假復(fù)層上皮,，到達氣管腔,。

這些細胞可以用于各種實驗，例如藥物篩選,、毒理學測試、免疫學研究等,。然而,，需要注意的是，這些細胞是經(jīng)過人工培養(yǎng)的,，可能存在一些與天然組織不同的特性,。

二、大鼠氣管上皮細胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇大鼠氣管上皮細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考,，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主,。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000 rpm條件下離心3 min,，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中,，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度,。

2)大鼠氣管上皮細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng)。

a,、棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

b,、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞,，棄去消化液,，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

c,、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中,，1000 rpm離心4 min,，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻,。

d,、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

3)大鼠氣管上皮細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時,，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為例,；

a,、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中,，1000 rpm條件下離心4 min,，棄去上清液，用PBS清洗一遍,，棄盡PBS,，進行細胞計數(shù)。

b,、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液,，使細胞密度5×106~1×107/mL,，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液,，注意凍存管做好標識,。

c、將凍存管放入-80℃冰箱,，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存,。記錄凍存管位置以便下次拿取。

三,、應(yīng)用

大鼠氣管上皮細胞可以用于苯并（a）芘對大鼠氣管—支氣管上皮細胞p16,、RASSF1A基因甲基化的影響：

觀察不同濃度的苯并(a)芘在不同時間對原代培養(yǎng)的大鼠氣管上皮細胞p16、RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化程度的影響,。

方法：

(1)采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代大鼠氣管上皮細胞,；

(2)噻唑蘭(MTT)還原實驗檢測系列苯并(a)芘濃度和不同作用時間對原代大鼠氣管上皮細胞增殖活性的影響；

(3)應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)檢測不同濃度的苯并(a)芘對原代大鼠氣管上皮細胞p16,、RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化程度的影響,。

結(jié)果：

(1)在本實驗室成功建立了用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代大鼠氣管上皮細胞的方法；

(2)MTT實驗結(jié)果顯示苯并(a)芘濃度在10.0μmol/L及以下時,，72h內(nèi)大鼠氣管上皮細胞抑制率均小于50%,，具有明顯的抑制增殖作用，并呈劑量依賴性,；

(3)以0.1,、1.0、10μmol/L的苯并(a)芘分別處理原代大鼠氣管上皮細胞24h,、48h,、72h后，發(fā)現(xiàn)p16和RASSF1A基因啟動子區(qū)均未發(fā)生甲基化,，并通過測序驗證,。

結(jié)論：

(1)組織塊培養(yǎng)法是培養(yǎng)原代大鼠氣管-支氣管上皮細胞的較好方法，方法簡便,，易操作；

(2)苯并(a)芘對大鼠氣管-支氣管上皮細胞的毒性隨著苯并(a)芘濃度的增大而增大,，具有明顯的抑制增殖作用,，并呈劑量依賴性；

(3)0.1,、1.0,、10μmol/L的苯并(a)芘對原代大鼠氣管-支氣管上皮細胞分別作用24h、48h,、72h,，不會引起p16,、RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化。

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