一、背景

TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系是由湖北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院建立,，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在RPMI＋15％小牛血清的培養(yǎng)液中,。TSCCa細(xì)胞系是被HELA污染的細(xì)胞系。

二,、TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1）復(fù)蘇TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

3）TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。

下面T25瓶為類,；

1.細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后,，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶,，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化,，可使用血球計數(shù)板計數(shù),。

2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞,，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO,，輕輕混勻,，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml,，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液,，注意凍存管做好標(biāo)識。

3.將凍存管置于程序降溫盒中,，放入-80度冰箱,，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取,。

三、應(yīng)用

TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系可以用于轉(zhuǎn)染IL-18基因聯(lián)合二萜生物堿對舌鱗癌細(xì)胞Tscca的增殖抑制與促凋亡作用：

構(gòu)建白介素-18(IL-18)真核表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將IL-18基因轉(zhuǎn)染入TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系,同時分別加入不同濃度的二萜生物堿(DA),分別采用流式細(xì)胞術(shù),、MTT實驗檢測細(xì)胞凋亡與增殖抑制情況,最后通過檢測Akt/p-Akt通路探究IL-18聯(lián)合二萜生物堿對TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系可能凋亡機制,。

方法：

1、根據(jù)Gen Bank中IL-18 DNA序列,設(shè)計并合成IL-18基因特異性引物;

2,、提取人新鮮血液中單個核淋巴細(xì)胞(PBMC),提PBMC的總RNA,RT-PCR方法獲得其c DNA,PCR擴增目的片段,構(gòu)建PEGFPN3-IL-18真核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)酶切和測序均鑒定正確后瞬時轉(zhuǎn)染TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率;

3,、DMSO溶解二萜生物堿,調(diào)整其濃度為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml,、0.6 mg/ml;4,、MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測空白對照組(未處理Tscca細(xì)胞)、IL-18組(僅轉(zhuǎn)染IL-18),、單獨二萜生物堿組(分為0.2 mg/ml,、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml 3組)及聯(lián)合組(分為IL-18+0.2 mg/ml,、IL-18+0.4 mg/ml,、IL-18+0.6 mg/ml 3組)對TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系生長的影響與細(xì)胞凋亡情況;5、Western blot實驗檢測各組細(xì)胞信號調(diào)節(jié)激酶Akt/p-Akt的蛋白水平,分析IL-18聯(lián)合二萜生物堿是否在此條通路發(fā)揮一定作用從而抑制TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系的增殖,。

結(jié)果：

1,、成功構(gòu)建PEGFPN3-IL-18真核表達(dá)質(zhì)粒;

2、成功轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞,且熒光鏡下觀察轉(zhuǎn)染PEGFPN3-IL-18真核表達(dá)質(zhì)粒的TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡增加;

3,、二萜生物堿濃度為0.2,、0.4、0.6 mg/ml時,隨濃度增大TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凋亡增多,且均有p<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;

4,、IL-18與二萜生物堿聯(lián)合對Tscca細(xì)胞作用48 h后,較單獨使用二萜生物堿抑制作用明顯,且呈濃度依賴性,均有p<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;5,、IL-18聯(lián)合二萜生物堿還可劑量依賴性地降低p-Akt的蛋白水平,各組均有p<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而總Akt水平幾乎不變。

結(jié)論：

1,、二萜生物堿對TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞有增殖抑制及促凋亡作用,且呈濃度依賴性;

2,、IL-18聯(lián)合二萜生物堿對TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系有協(xié)同抑制作用,且抑制作用較單獨使用IL-18或二萜生物堿均較強;

3、IL-18聯(lián)合二萜生物堿在抑制p-Akt的表達(dá)及活化這條信號通路上發(fā)揮一定作用從而抑制TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系的增殖并促進(jìn)其凋亡,。

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