樹突狀細胞（dendritic cells,DC)是目前所知的功能的抗原呈遞細胞,，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC參與免疫應答的啟動和調節(jié),，在腫瘤學及其他學科的作用也日益受到重視,。人外周血中DC含量很少，僅占單個核細胞的0.1％～1%,。利用細胞黏附和密度梯度離心的方法雖然可分離純化外周血樹突狀細胞,，但此法分離的DC，不僅純度低,，數量少,，而且處于不同的分化階段，已難以滿足臨床研究的需要,。隨著人們對DC發(fā)生學的認識不斷深入,，許多學者開始用多種細胞因子誘導不同的前體細胞沿著不同的分化途徑在體外擴增DC。

一,、人外周血單個核細胞誘導DC

外周血中DC前體（CD34+細胞）有進一步分化的潛能,。在外周血單個核細胞體外培養(yǎng)中，添加一定劑量的粒細胞單核細胞一集落刺激因子（GM-CSF）和白細胞介素-4(IL-4),DC前體細胞可分化成樹突狀細胞,，而僅在GM-CSF條件下培養(yǎng),，則該前體細胞分化成巨噬細胞。IL-4具有抑制巨噬細胞生長的作用,。加入TNF-α共同培養(yǎng),，可促進DC的成熟。

（一）材料

1,、分離外周血單個核細胞所需試劑,；

2、10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液,；

3,、IL-4,GM-CSF,TNF-α。

（二）方法

1,、常規(guī)方法分離外周血單個核細胞,，并通過玻璃吸附法獲得單核細胞。

2,、用10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細胞，調細胞濃度為106/ml,。

3,、將單核細胞懸液加入24孔培養(yǎng)板中,，1 ml／孔，并加入IL-4(50ng）與GM-CSF(100ng),置37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，3天后用含有IL-4與GM-CSF及10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液半量換液,。

4、培養(yǎng)7天后,，換用含TNF-α 20ng/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2～7天后顯微鏡下觀察,，可見樹突狀細胞比淋巴細胞大，直徑在10～20um之間,，有許多刺狀突起,，分布于細胞表面。

（三）結果

收集懸浮細胞,，洗滌后重懸于RPMI 1640培養(yǎng)液中備用,。

（四）注意事項

1、進行半量換液時,，注意不要將細胞吸出,。

2、可以用IL-13替代IL-4,，與GM-CSF構成聯(lián)合培養(yǎng)體系,。因其與IL-4具有相似的性質。

3,、DC細胞尚無特異性標記,，上述分離細胞表面標記應為CD3（-）、CD4（-）,、CD8（-）,、CD19（-）,CD21（-）,CD16（-）,CD14（-）和MHC-Ⅱ（+），可以用FCM或免疫熒光法分析鑒定,。

二,、DC的功能檢測

DC在分離過程中和分離后，只要與培養(yǎng)器皿接觸發(fā)生黏附,，即可被活化,，此時檢測到的細胞功能已不準確；此外,，通過分離獲得的DC,，其中包含功能各不一致的多種群體。因此,，對DC功能的檢測尚無統(tǒng)一的方法,。目前檢測DC功能的方法有：

1、DC抗原捕獲能力的檢測，收集DC,，配成1x106/ml細胞懸液,，取100ul加入等量FITC標記的葡聚糖，37℃靜置60分鐘,，PBS洗兩次,，用流式細胞儀檢測信號強度。

2,、利用混合淋巴細胞培養(yǎng)（MLC)的方法檢測DC的功能,，如果能增強MLC，說明DC具有呈遞抗原的作用,。但這僅僅能反映一部分DC的功能,，有部分DC具有誘導特異性免疫耐受的作用，因此不能增強MLC的反應強度,，反而抑制MLC的反應強度,。

3、采用特異性抗原預處理DC后,，再與淋巴細胞孵育,，觀察淋巴細胞的增殖情況，由于對特異性抗原發(fā)生免疫應答的淋巴細胞較少,，故一般只有采用3H-TdR摻入等敏感的方法檢測,。

4、利用某些刺激劑,，如金黃色葡萄球菌,，可以刺激DC分泌IL-12，通過檢測DC分泌的IL-12的量來反映DC的功能,。

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