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微生物常用檢測方法的原理及應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn),!

來源:北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司   2025年06月04日 16:25  

百歐博偉生物:微生物的檢測,無論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義。常見的檢測方法有:生長量測定法,、微生物計(jì)數(shù)法、生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微生物檢測等,,本文主要介紹常用的檢測方法的的原理,,應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。

 

微生物生長意味著原生質(zhì)含量的增加,,所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù),,而測定繁殖則都要建立在計(jì)數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長的衡量,,可以從其重量,,體積,密度,,濃度,,做指標(biāo)來進(jìn)行衡量。

 

一,、生長量測定法

 

1,、體積測量法:又稱測菌絲濃度法。

 

原理:通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況,。

 

菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個(gè)重要監(jiān)測指標(biāo),。這種方法比較粗放,簡便,,快速,,但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件,否則偏差很大,,由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物,,結(jié)果會(huì)有一定偏差。

 

2,、稱干重法:

 

原理:利用離心或過濾法測定,。一般干重為濕重的10-20%,。稱干重發(fā)法較為煩瑣,通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí),,常采用這種方法,,如活性干酵母(activity dry yeast, ADY),一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。

 

3,、比濁法:

 

原理:微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高,。通過紫外分光光度計(jì)測定一定波長下的吸光值,判斷微生物的生長狀況,。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測,。

 

4、菌絲長度測量法:

 

方法:對于絲狀真菌和一些放線菌,,可以在培養(yǎng)基上測定一定時(shí)間內(nèi)菌絲生長的長度

 

二,、微生物計(jì)數(shù)法

 

1、血球計(jì)數(shù)板法:

 

這種方法簡便,,直觀,,快捷,但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù),,并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù),。

 

2、染色計(jì)數(shù)法:

 

為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù),,而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足,,人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。

 

3,、比例計(jì)數(shù)法:

 

將已知顆粒(如霉菌孢子或紅細(xì)胞)濃度的液體與一待測細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合,,在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目,即可得未知菌液的細(xì)胞濃度,。

 

4,、液體稀釋法:

 

對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋,根據(jù)估計(jì)數(shù),,從宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣,,接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中,經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù),,然后查或然數(shù)表MPN(most probably number)得出菌樣的含菌數(shù),,根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測,,例如飲用水和牛奶的微生物,。

 

5、平板菌落計(jì)數(shù)法:

 

這是一種的活菌計(jì)數(shù)法,。但方法比較麻煩,,操作者需有熟練的技術(shù),。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù),而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng),,獲得了單克隆。

 

6,、試劑紙法:

 

在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上,,發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確,,相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差,。

 

7、膜過濾法:

 

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品,,經(jīng)丫叮橙染色,,在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光,活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光,,而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光,。

 

三、生理指標(biāo)法

 

微生物的生長伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化,,例如酸堿度,,發(fā)酵液中的含氮量,含糖量,,產(chǎn)氣量等,,與生長量相平行的生理指標(biāo)很多,它們可作為生長測定的相對值,。

 

1,、測定含氮量:

 

大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%,酵母為7.5%,,霉菌為6.0%,。根據(jù)含氮量×6.25,即可測定粗蛋白的含量,。含氮量的測定方法有很多,,如用硫酸,過氯酸,,碘酸,,磷酸等消化法和Dumas測氮?dú)夥ā?/span>

 

2、測定含碳量:

 

將少量(干重0.2-2.0 mg)生物材料混入1毫升水或無機(jī)緩沖液中,,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻,。加水稀釋至5毫升,在580nm的波長下讀取吸光光度值,,即可推算出生長量,。需用試劑做空白對照,,用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

3,、還原糖測定法:

 

還原糖通常是指單糖或寡糖,,可以被微生物直接利用,通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況,,常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測,。

 

4、氨基氮的測定:

 

方法是,,離心發(fā)酵液,,取上清液,加入甲基紅和鹽酸作指示劑,,加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去,,加入底物18%的中性甲醛,反應(yīng)數(shù)刻,,加入0.02N的使之變色,,根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量,,可間接反映微生物的生長狀況,。

 

5、其他生理物質(zhì)的測定:

 

P,,DNA,,RNA,ATP,,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及產(chǎn)酸,,產(chǎn)氣,產(chǎn)CO2(用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)),,耗氧,,黏度,產(chǎn)熱等指標(biāo),, 都可用于生長量的測定,。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化,最終產(chǎn)氣量,,微生物活性三方面的測定反映微生物的生長,。

 

四、商業(yè)化快速微生物檢測法

 

微生物的檢測,,其發(fā)展方向是快速,,準(zhǔn)確,簡便,自動(dòng)化,,當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測原理,,結(jié)合不同的檢測方法,設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測儀器設(shè)備,,正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測和科學(xué)研究領(lǐng)域,。例如:

 

1、抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測技術(shù)

 

2,、BACTOMETER 全自動(dòng)各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測系統(tǒng)

 

這些儀器和設(shè)備的生產(chǎn)廠家很多,,產(chǎn)品各異,在此不做一一介紹,,具體可查看各公司的產(chǎn)品說明。

 

在微生物檢驗(yàn)操作過程中,,要保證檢測環(huán)境(如超凈臺(tái),、檢測室)以及所用工器具的潔凈程度,同時(shí)保證人員各種操作的規(guī)范性,,盡量保證其無菌性,,防止因人為原因操作失誤而出現(xiàn)誤差結(jié)果,同時(shí)在適宜溫度進(jìn)行培養(yǎng),,為合理決策和指導(dǎo)生產(chǎn)提供依據(jù),。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,我們應(yīng)做好以下幾個(gè)方面,。

 

(一)培養(yǎng)基的滅菌及使用

 

1,、每次配制時(shí),要注意其生產(chǎn)日期是否在保質(zhì)期內(nèi),,查看其開瓶日期及瓶口密封性,,保證其未變質(zhì),并且未吸潮,。

 

2,、培養(yǎng)基配制時(shí),稱量要準(zhǔn)確,,包括鹽水的分裝要準(zhǔn)確,。

 

3、一定要保證現(xiàn)配制現(xiàn)滅菌,,未滅菌的配好培養(yǎng)基不能長時(shí)間放置,,更不可隔夜。

 

4,、滅菌時(shí)要保證恒溫,、恒壓,同時(shí)要保證有效的滅菌時(shí)間。

 

5,、滅菌過的培養(yǎng)基要冰箱保存,,可保存一周,一般不超過 3 天,。而且要遵循“先入先出”原則,,先配制的要先使用。

 

6,、在使用時(shí),,要根據(jù)當(dāng)班次的使用量,用水浴鍋先將培養(yǎng)基溶化為液態(tài),,然后及時(shí)調(diào)低水浴溫度(先化好的可從水浴取出,,放在水浴鍋鍋蓋上)待用,千萬不可長時(shí)間使培養(yǎng)基處于高溫狀態(tài),。

 

7,、做產(chǎn)品微生物檢測時(shí),傾倒培養(yǎng)基溫度在 45℃左右,,不可過燙,,避免將菌燙死;也不可過涼,,化好的培養(yǎng)基又結(jié)塊凝固,,不便于觀察結(jié)果。

 

8,、每瓶培養(yǎng)基均要做空白,。

 

9、盡量集中做樣,,避免頻繁打開同一瓶培養(yǎng)基瓶塞,,增大培養(yǎng)基的污染幾率,出現(xiàn)誤差結(jié)果,。

 

10,、培養(yǎng)基剩余過少時(shí),可先將其傾倒成空白用板,。

 

(二)檢測環(huán)境的維持

 

1,、大環(huán)境(檢測室)

 

1)檢測時(shí),窗戶和空調(diào)要關(guān)閉,,或用酒精對房間進(jìn)行噴霧消毒,,避免房間內(nèi)空氣流通影響超凈臺(tái)內(nèi)部環(huán)境(在有通排風(fēng)系統(tǒng)的恒溫恒濕無菌間進(jìn)行操作)。

 

2)如果在原來的原料微生物檢測室進(jìn)行檢測,,要定期開啟紫外燈,,對房間進(jìn)行殺菌,。

 

2、小環(huán)境(超凈工作臺(tái))

 

1)定期清潔初效過濾器,,要及時(shí)更換,。

 

2)檢測前,將超凈臺(tái)內(nèi)部進(jìn)行清潔,,用 75%酒精進(jìn)行擦拭消毒,,并提前半小時(shí)將超凈臺(tái)紫外燈打開,對超凈臺(tái)內(nèi)部環(huán)境進(jìn)行殺菌,。

 

3)關(guān)紫外燈,,開風(fēng)機(jī),調(diào)整合適進(jìn)風(fēng)量,,風(fēng)量不可過低,。

 

4)每次檢測后,要對超凈臺(tái)內(nèi)部進(jìn)行清理,、清潔,,并用 75%酒精進(jìn)行擦拭消毒。

 

5)紫外燈根據(jù)其使用壽命要及時(shí)更換,。

 

6)檢測同時(shí),,要做上相應(yīng)菌落檢測的環(huán)境空白,。

 

7)檢測區(qū)域的選擇:

 

a,、一般在距離超凈臺(tái)外沿的 1/3-2/3 區(qū)域進(jìn)行無菌操作;

 

b,、要在酒精燈火焰的外焰保護(hù)區(qū)域進(jìn)行操作,。

 

(三)工器具的潔凈度

 

1、玻璃器皿:采用干熱滅菌方式進(jìn)行滅菌,。

 

2,、檢測用剪刀、勺子等物品要做到檢測專用,,不可與其它操作器具混用,,使用時(shí),先用75%酒精消毒,,再采用灼燒方式進(jìn)行滅菌,。

 

3、接種針(環(huán))采用灼燒方式進(jìn)行滅菌,,但要注意檢測時(shí)要先將接種針(環(huán))進(jìn)行冷卻,。

 

(四)樣品的采集及檢測

 

1、保證采樣器具的無菌性

 

1)玻璃器皿:采用干熱滅菌方式進(jìn)行滅菌,,保證恒溫,、時(shí)間足夠(但不可時(shí)間過長,容易導(dǎo)致玻璃器皿易裂紋而報(bào)廢)。

 

2)取樣筐:使用前要用75%酒精進(jìn)行噴灑消毒,。

 

3)取樣勺:要保證其清潔消毒,,清潔后用75%酒精進(jìn)行擦拭消毒。

 

4)取樣袋:可先用酒精進(jìn)行擦拭消毒,,再在超凈臺(tái)用紫外燈照射消毒,,(包裝車間要在傳遞窗用紫外燈照射消毒)。

 

5)電子稱表面用 75%酒精消毒,。

 

2,、人員操作

 

1)保證手部的清洗、消毒:取樣前及檢測前都要先洗手再消毒,。

 

2)取樣要具有代表性(隨機(jī)樣,、目的樣、綜合樣)且要標(biāo)示清楚,。

 

3)取樣完畢,,不可在車間逗留,要及時(shí)將樣品放入超凈臺(tái),,對其外表面進(jìn)行紫外燈照射消毒,。

 

4)在要求的檢測區(qū)域進(jìn)行操作。

 

5)檢測前,,要用 75%酒精棉球?qū)悠反诓窟M(jìn)行擦拭消毒,,再開口。

 

6)往鹽水瓶加樣品時(shí),,要注意勺子或袋子盡量不接觸瓶口,。

 

7)樣品計(jì)量要準(zhǔn)確,稀釋倍數(shù)也要準(zhǔn)確(1mL 吸管不允許將管口敲掉),,進(jìn)行 100 倍稀釋時(shí),,1mL 吸管要伸入鹽水中,不可以將樣品從管壁流下去,,同時(shí)要避免將管底部捅破,。

 

8)鹽水溫度以 40℃左右為宜,不能過熱,,會(huì)將部分微生物燙死,;也不能溫度太低,不能將樣品溶解,。

 

9)進(jìn)行稀釋時(shí),,要搖勻,保證溶液的均一性,。

 

10)傾倒平皿時(shí),,要注意培養(yǎng)基瓶口不要接觸到平皿,;傾倒的培養(yǎng)基要適量,不可以太少,,在培養(yǎng)過程中易干掉,,微生物亦死亡,以 15mL 左右為宜,。

 

11)做大腸菌群樣時(shí),,要提前將乳糖膽鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)管按需要量備好,放入超凈臺(tái)對外表面進(jìn)行紫外線滅菌,。

 

12)接二步時(shí),,要注意先將接種針(環(huán))進(jìn)行冷卻,避免出現(xiàn)接不上菌落的情況,,導(dǎo)致無法判斷,、確認(rèn)。

 

13)檢測完畢,,及時(shí)放入相應(yīng)培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),,并清理清潔超凈臺(tái)。

 

(五)微生物的培養(yǎng)

 

1,、在培養(yǎng)過程中,,要隨時(shí)監(jiān)控培養(yǎng)箱溫度,保證其在適宜的溫度進(jìn)行培養(yǎng),。

 

2,、要按照《微生物檢驗(yàn)規(guī)范》要求及時(shí)觀察結(jié)果,出現(xiàn)異常,,要及時(shí)分析原因進(jìn)行反饋,。

 

五,、思考與討論

 

微生物的生長不同于其他生物的生長,,微生物的個(gè)體生長在科研上有一定困難,通常情況下也沒有實(shí)際意義,。微生物是以量取勝的,,因此,微生物的生長通常指群體的擴(kuò)增,。

 

北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有Biolog微生物鑒定系統(tǒng),,超低溫冰箱,生物安全柜等儀器設(shè)備可進(jìn)行對微生物分離,、鑒定等常規(guī)的分子實(shí)驗(yàn)研究,。對我國生命科學(xué)研究、生物技術(shù)創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求進(jìn)行積極的面對社會(huì)乃至國外收集保藏提供微生物菌種資源,。在保證生物安全和保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的前提下,,為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn),、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護(hù),、科研教育提供微生物物種資源,、基因資源、信息資源和專業(yè)技術(shù)服務(wù),。

 

除此之外,,我們還擁有對菌種、細(xì)胞,、培養(yǎng)基,、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù),對購買項(xiàng)目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項(xiàng)目準(zhǔn)確到位,,都有相關(guān)人士進(jìn)行維護(hù),確保您在微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得優(yōu)質(zhì)服務(wù),!也正因?yàn)榇耍本┌贇W博偉生物技術(shù)有限公司與國內(nèi)外多家研制單位,、生物制藥,、第三方檢測機(jī)構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好,、長期和穩(wěn)定的合作關(guān)系,!


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