百歐博偉生物：微生物的檢測，無論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義。常見的檢測方法有：生長量測定法,、微生物計(jì)數(shù)法、生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微生物檢測等,，本文主要介紹常用的檢測方法的的原理,，應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。

微生物生長意味著原生質(zhì)含量的增加,，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù),，而測定繁殖則都要建立在計(jì)數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長的衡量,，可以從其重量,，體積，密度,，濃度,，做指標(biāo)來進(jìn)行衡量。

一,、生長量測定法

1,、體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

原理：通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況,。

菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個(gè)重要監(jiān)測指標(biāo),。這種方法比較粗放，簡便,，快速,，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件，否則偏差很大,，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物,，結(jié)果會(huì)有一定偏差。

2,、稱干重法：

原理：利用離心或過濾法測定,。一般干重為濕重的10-20%,。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí),，常采用這種方法,，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。

3,、比濁法：

原理：微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高,。通過紫外分光光度計(jì)測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況,。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測,。

4、菌絲長度測量法：

方法：對于絲狀真菌和一些放線菌,，可以在培養(yǎng)基上測定一定時(shí)間內(nèi)菌絲生長的長度

二,、微生物計(jì)數(shù)法

1、血球計(jì)數(shù)板法：

這種方法簡便,，直觀,，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù),，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù),。

2、染色計(jì)數(shù)法：

為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù),，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足,，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。

3,、比例計(jì)數(shù)法：

將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合,，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度,。

4,、液體稀釋法：

對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計(jì)數(shù),，從宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣,，接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù),，然后查或然數(shù)表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數(shù),，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測,，例如飲用水和牛奶的微生物,。

5、平板菌落計(jì)數(shù)法：

這是一種的活菌計(jì)數(shù)法,。但方法比較麻煩,，操作者需有熟練的技術(shù),。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng),，獲得了單克隆。

6,、試劑紙法：

在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上,，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確,，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差,。

7、膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品,，經(jīng)丫叮橙染色,，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光,，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光,。

三、生理指標(biāo)法

微生物的生長伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化,，例如酸堿度,，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量,，產(chǎn)氣量等,，與生長量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長測定的相對值,。

1,、測定含氮量：

大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%,，霉菌為6.0%,。根據(jù)含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量,。含氮量的測定方法有很多,，如用硫酸，過氯酸,，碘酸,，磷酸等消化法和Dumas測氮?dú)夥ā?/span>

2、測定含碳量：

將少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無機(jī)緩沖液中,，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻,。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值,，即可推算出生長量,。需用試劑做空白對照,，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3,、還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖,，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況,，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測,。

4、氨基氮的測定：

方法是,，離心發(fā)酵液,，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑,，加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去,，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻,，加入0.02N的使之變色,，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量,，可間接反映微生物的生長狀況,。

5、其他生理物質(zhì)的測定：

P,，DNA,，RNA，ATP,，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸,，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2（用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)）,，耗氧,，黏度，產(chǎn)熱等指標(biāo),， 都可用于生長量的測定,。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量,，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長,。

四、商業(yè)化快速微生物檢測法

微生物的檢測,，其發(fā)展方向是快速,，準(zhǔn)確，簡便，自動(dòng)化,，當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測原理,，結(jié)合不同的檢測方法，設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測儀器設(shè)備,，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測和科學(xué)研究領(lǐng)域,。例如：

1、抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測技術(shù)

2,、BACTOMETER 全自動(dòng)各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測系統(tǒng)

這些儀器和設(shè)備的生產(chǎn)廠家很多,，產(chǎn)品各異，在此不做一一介紹,，具體可查看各公司的產(chǎn)品說明。

在微生物檢驗(yàn)操作過程中,，要保證檢測環(huán)境(如超凈臺(tái),、檢測室)以及所用工器具的潔凈程度，同時(shí)保證人員各種操作的規(guī)范性,，盡量保證其無菌性,，防止因人為原因操作失誤而出現(xiàn)誤差結(jié)果，同時(shí)在適宜溫度進(jìn)行培養(yǎng),，為合理決策和指導(dǎo)生產(chǎn)提供依據(jù),。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們應(yīng)做好以下幾個(gè)方面,。

（一）培養(yǎng)基的滅菌及使用

1,、每次配制時(shí)，要注意其生產(chǎn)日期是否在保質(zhì)期內(nèi),，查看其開瓶日期及瓶口密封性,，保證其未變質(zhì)，并且未吸潮,。

2,、培養(yǎng)基配制時(shí)，稱量要準(zhǔn)確,，包括鹽水的分裝要準(zhǔn)確,。

3、一定要保證現(xiàn)配制現(xiàn)滅菌,，未滅菌的配好培養(yǎng)基不能長時(shí)間放置,，更不可隔夜。

4,、滅菌時(shí)要保證恒溫,、恒壓，同時(shí)要保證有效的滅菌時(shí)間。

5,、滅菌過的培養(yǎng)基要冰箱保存,，可保存一周，一般不超過 3 天,。而且要遵循“先入先出”原則,，先配制的要先使用。

6,、在使用時(shí),，要根據(jù)當(dāng)班次的使用量，用水浴鍋先將培養(yǎng)基溶化為液態(tài),，然后及時(shí)調(diào)低水浴溫度（先化好的可從水浴取出,，放在水浴鍋鍋蓋上）待用，千萬不可長時(shí)間使培養(yǎng)基處于高溫狀態(tài),。

7,、做產(chǎn)品微生物檢測時(shí)，傾倒培養(yǎng)基溫度在 45℃左右,，不可過燙,，避免將菌燙死；也不可過涼,，化好的培養(yǎng)基又結(jié)塊凝固,，不便于觀察結(jié)果。

8,、每瓶培養(yǎng)基均要做空白,。

9、盡量集中做樣,，避免頻繁打開同一瓶培養(yǎng)基瓶塞,，增大培養(yǎng)基的污染幾率，出現(xiàn)誤差結(jié)果,。

10,、培養(yǎng)基剩余過少時(shí)，可先將其傾倒成空白用板,。

（二）檢測環(huán)境的維持

1,、大環(huán)境（檢測室）

（1）檢測時(shí)，窗戶和空調(diào)要關(guān)閉,，或用酒精對房間進(jìn)行噴霧消毒,，避免房間內(nèi)空氣流通影響超凈臺(tái)內(nèi)部環(huán)境（在有通排風(fēng)系統(tǒng)的恒溫恒濕無菌間進(jìn)行操作）。

（2）如果在原來的原料微生物檢測室進(jìn)行檢測,，要定期開啟紫外燈,，對房間進(jìn)行殺菌,。

2、小環(huán)境（超凈工作臺(tái)）

（1）定期清潔初效過濾器,，要及時(shí)更換,。

（2）檢測前，將超凈臺(tái)內(nèi)部進(jìn)行清潔,，用 75%酒精進(jìn)行擦拭消毒,，并提前半小時(shí)將超凈臺(tái)紫外燈打開，對超凈臺(tái)內(nèi)部環(huán)境進(jìn)行殺菌,。

（3）關(guān)紫外燈,，開風(fēng)機(jī)，調(diào)整合適進(jìn)風(fēng)量,，風(fēng)量不可過低,。

（4）每次檢測后，要對超凈臺(tái)內(nèi)部進(jìn)行清理,、清潔,，并用 75%酒精進(jìn)行擦拭消毒。

（5）紫外燈根據(jù)其使用壽命要及時(shí)更換,。

（6）檢測同時(shí),，要做上相應(yīng)菌落檢測的環(huán)境空白,。

（7）檢測區(qū)域的選擇：

a,、一般在距離超凈臺(tái)外沿的 1/3-2/3 區(qū)域進(jìn)行無菌操作；

b,、要在酒精燈火焰的外焰保護(hù)區(qū)域進(jìn)行操作,。

（三）工器具的潔凈度

1、玻璃器皿：采用干熱滅菌方式進(jìn)行滅菌,。

2,、檢測用剪刀、勺子等物品要做到檢測專用,，不可與其它操作器具混用,，使用時(shí)，先用75%酒精消毒,，再采用灼燒方式進(jìn)行滅菌,。

3、接種針（環(huán)）采用灼燒方式進(jìn)行滅菌,，但要注意檢測時(shí)要先將接種針（環(huán)）進(jìn)行冷卻,。

（四）樣品的采集及檢測

1、保證采樣器具的無菌性

（1）玻璃器皿：采用干熱滅菌方式進(jìn)行滅菌,，保證恒溫,、時(shí)間足夠（但不可時(shí)間過長，容易導(dǎo)致玻璃器皿易裂紋而報(bào)廢）。

（2）取樣筐：使用前要用75%酒精進(jìn)行噴灑消毒,。

（3）取樣勺：要保證其清潔消毒,，清潔后用75%酒精進(jìn)行擦拭消毒。

（4）取樣袋：可先用酒精進(jìn)行擦拭消毒,，再在超凈臺(tái)用紫外燈照射消毒,，（包裝車間要在傳遞窗用紫外燈照射消毒）。

（5）電子稱表面用 75%酒精消毒,。

2,、人員操作

（1）保證手部的清洗、消毒：取樣前及檢測前都要先洗手再消毒,。

（2）取樣要具有代表性（隨機(jī)樣,、目的樣、綜合樣）且要標(biāo)示清楚,。

（3）取樣完畢,，不可在車間逗留，要及時(shí)將樣品放入超凈臺(tái),，對其外表面進(jìn)行紫外燈照射消毒,。

（4）在要求的檢測區(qū)域進(jìn)行操作。

（5）檢測前,，要用 75%酒精棉球?qū)悠反诓窟M(jìn)行擦拭消毒,，再開口。

（6）往鹽水瓶加樣品時(shí),，要注意勺子或袋子盡量不接觸瓶口,。

（7）樣品計(jì)量要準(zhǔn)確，稀釋倍數(shù)也要準(zhǔn)確（1mL 吸管不允許將管口敲掉）,，進(jìn)行 100 倍稀釋時(shí),，1mL 吸管要伸入鹽水中，不可以將樣品從管壁流下去,，同時(shí)要避免將管底部捅破,。

（8）鹽水溫度以 40℃左右為宜，不能過熱,，會(huì)將部分微生物燙死,；也不能溫度太低，不能將樣品溶解,。

（9）進(jìn)行稀釋時(shí),，要搖勻，保證溶液的均一性,。

（10）傾倒平皿時(shí),，要注意培養(yǎng)基瓶口不要接觸到平皿,；傾倒的培養(yǎng)基要適量，不可以太少,，在培養(yǎng)過程中易干掉,，微生物亦死亡，以 15mL 左右為宜,。

（11）做大腸菌群樣時(shí),，要提前將乳糖膽鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)管按需要量備好，放入超凈臺(tái)對外表面進(jìn)行紫外線滅菌,。

（12）接二步時(shí),，要注意先將接種針（環(huán)）進(jìn)行冷卻，避免出現(xiàn)接不上菌落的情況,，導(dǎo)致無法判斷,、確認(rèn)。

（13）檢測完畢,，及時(shí)放入相應(yīng)培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),，并清理清潔超凈臺(tái)。

（五）微生物的培養(yǎng)

1,、在培養(yǎng)過程中,，要隨時(shí)監(jiān)控培養(yǎng)箱溫度，保證其在適宜的溫度進(jìn)行培養(yǎng),。

2,、要按照《微生物檢驗(yàn)規(guī)范》要求及時(shí)觀察結(jié)果，出現(xiàn)異常,，要及時(shí)分析原因進(jìn)行反饋,。

五,、思考與討論

微生物的生長不同于其他生物的生長,，微生物的個(gè)體生長在科研上有一定困難，通常情況下也沒有實(shí)際意義,。微生物是以量取勝的,，因此，微生物的生長通常指群體的擴(kuò)增,。

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