百歐博偉生物：自然界中廣泛存在著各種微生物,，這些微生物在食品生產(chǎn)各個環(huán)節(jié)中都可能會對食品造成污染,。陶老師是微生物控制領(lǐng)域具有深厚影響力的學(xué)者,，為了更加深入的了解微生物快速檢測方法，陶老師整理了關(guān)于食品中的微生物快速檢測的一些問題,，并就這些問題一一作出了解答,。

1、如何定義食品中微生物快速檢測方法,？

食品快速檢測的廣泛定義是簡單,、快速、準(zhǔn)確的分析方法,，能夠?qū)μ幚砗玫臉悠吩诤芏痰臅r間內(nèi)檢測出結(jié)果,。如今，大部分理化項目快速檢測方法可以實現(xiàn)在幾小時甚至幾分鐘內(nèi)檢測出結(jié)果,。

快速檢測方法具有如下一個或者幾個特點：

（1）檢測時間比標(biāo)準(zhǔn)方法短,；

（2）操作簡單，流程簡單,，判斷明確,；

（3）靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確,；

（4）實現(xiàn)自動化,。

但是,，對于食品中微生物檢測而言，必須經(jīng)歷培養(yǎng),、增菌等階段,，無法實現(xiàn)在1~2個小時內(nèi)出結(jié)果。

2,、食品中微生物快速檢測方法具備的特點,？

食品中微生物快速檢測方法具有如下一個或者幾個特點：

（1）操作簡便，檢測速度快,，檢測時間短,；

（2）靈敏度高、特異性強,，檢測結(jié)果更為精確,；

（3）自動化程度高，減少人為參與,，降低人工成本,；

（4）對檢驗人員經(jīng)驗依賴程度低，操作簡單,，易于標(biāo)準(zhǔn)化,；

（5）產(chǎn)品更小、更輕,、更便攜,，更適合現(xiàn)場檢測。

3,、目前常用的食品微生物快速檢測方法有哪些,？

常用的食品微生物快速檢測技術(shù)從大類上主要有：傳統(tǒng)計數(shù)改良方法，免疫學(xué)方法,，分子生物學(xué)方法,。

（1）傳統(tǒng)計數(shù)改良方法是在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的計數(shù)方法，克服傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時間長,、操作繁瑣,、誤差大等缺點，包括培養(yǎng)基改良法,、濾膜法,、紙片法。

（2）免疫方法是以抗原抗體的特異反應(yīng)為基礎(chǔ),，利用不同微生物特異抗原激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異抗體,，從其特異性檢測相應(yīng)的致病微生物。常用的免疫學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù),、免疫膠體金技術(shù),、上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù),、免疫磁珠分離技術(shù)和乳膠凝集法等。

（3）分子生物學(xué)方法,，其中PCR技術(shù)是應(yīng)用的分子生物學(xué)方法,，主要應(yīng)用為普通PCR，熒光定量PCR和等溫擴(kuò)增等,。

除以上常見快檢方法外,，近些年發(fā)展的飛行時間質(zhì)譜、微流控技術(shù),、流式細(xì)胞技術(shù),、新一代測序技術(shù)等新興技術(shù)也正在或?qū)⒁獞?yīng)用于食源性致病微生物的快速檢測。

4,、幾種食品微生物快速檢測方法的差異主要有哪些,？

改良的計數(shù)方法，克服傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時間長,、操作繁瑣,、誤差大等缺點，操作接近國標(biāo)方法,，目前使用泛,，可定量，可定性,。免疫學(xué)方法優(yōu)勢是特異性高,，操作時間短、檢測結(jié)果可靠,，適合批量檢測和自動化檢測（VIDAS）,，劣勢是高質(zhì)量抗體獲得困難、產(chǎn)品開發(fā)周期長,、檢測靈敏度受靶標(biāo)蛋白的影響大。分子學(xué)方法優(yōu)勢是靶標(biāo)明確,，操作時間短,、檢測結(jié)果可靠，但核酸提取效率和系統(tǒng)穩(wěn)定性是一大挑戰(zhàn),。

5,、如何評價一個食品微生物快速檢測體系？

食品中的微生物尤其是致病菌具有檢出率高但是含量低的特點,，故檢測方法的靈敏度和之間有著很大的差異,。因此，一個好的檢測系統(tǒng)應(yīng)該包括一個好的增菌培養(yǎng)方法和一個好的檢測方法,，二者要綜合起來一起評價,。一個好的增菌培養(yǎng)方法要滿足以下條件：微生物的復(fù)蘇能力要強,，生長速度要快，選擇性要好,，產(chǎn)量要高,；而一個好的檢測方法需要具備速度快、準(zhǔn)確度高,，結(jié)果準(zhǔn)確明晰等特點,。

6、目前有國家標(biāo)準(zhǔn)的食品微生物快速檢測方法有哪些,？

從GB 4789中可以看出,，顯色培養(yǎng)基、微生物鑒定系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用,，沙門氏菌,、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌,、副溶血弧菌可采用全自動微生物檢測鑒定系統(tǒng),，除此之外，還有以下方法也被國標(biāo)應(yīng)用：

（1）GB 4789.6-2016食品微生物學(xué)檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗中提到,，取生化反應(yīng)符合大腸埃希氏菌特征的菌落進(jìn)行PCR確認(rèn)試驗,。

（2）GB 4789.10-2016食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗中關(guān)于金葡腸毒素檢測，可用A,、B,、C、D,、E型金黃色葡萄球菌腸毒素分型酶聯(lián)免疫吸附試劑盒完成,。

（3）GB 4789.12-2016食品微生物學(xué)檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗毒素基因檢測采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。

（4）GB 4789.36-2016食品微生物學(xué)檢驗大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗,，可用免疫磁珠捕獲法檢測,，此外，毒力基因檢測采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增和檢測,。

（5）GB 4789.42-2016食品微生物學(xué)檢驗諾如病毒檢驗采用實時熒光RT－PCR方法進(jìn)行檢測,。

（6）GB 14934-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)消毒餐（飲）具可采用餐具大腸菌群紙片法進(jìn)行檢測。  

7,、國外微生物快速檢測方法的應(yīng)用情況如何,？

目前，就技術(shù)應(yīng)用而言,，歐盟使用傳統(tǒng)方法和快速方法的比例各占50%,；美國主要以快速方法(包括基于免疫學(xué)技術(shù)的側(cè)向?qū)游鲈嚰埡虴LISA試劑盒)和分子生物學(xué)方法(如PCR)為主，我國仍沿用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，這已經(jīng)難以滿足食品安全監(jiān)管及企業(yè)/行業(yè)對檢驗時效性的需求,。   

8,、目前大部分快速檢測方法沒有標(biāo)準(zhǔn)，企業(yè)可以用嗎,？

國家標(biāo)準(zhǔn)方法是不可替代的,，在產(chǎn)品出廠檢測、政府第三方出具報告等方面必須采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測,。目前微生物的國標(biāo)檢測方法普遍為培養(yǎng)法,，因此在談到微生物檢測的國標(biāo)時，通常指的是培養(yǎng)法,，但是隨著技術(shù)的進(jìn)步,，越來越多的新技術(shù)及其方法將進(jìn)入國家標(biāo)準(zhǔn)。

在企業(yè)質(zhì)量內(nèi)控,，如：原輔料檢測,、生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)測、過程產(chǎn)品監(jiān)測等歡迎都可以采用快速檢測方法,，但前提是,，所選的方法／產(chǎn)品，實驗室必須要跟國標(biāo)進(jìn)行比對,，對準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性就行測試后方可采用,。

9、企業(yè)如何選擇適合自己的微生物快速檢測方法,？

沒有方法,，只有的方法，企業(yè)在選擇快速檢測方法時要從產(chǎn)品,、檢測項目,、檢測量、預(yù)算等多個方面進(jìn)行考慮,。選擇快速檢測產(chǎn)品時,，要從產(chǎn)品的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性,、操作便捷,、成本等方面考慮。

（1）檢測樣品決定選用方法,。檢測方法均具有一定的適用范圍，例如,，諾如病毒的ELISA試劑盒適用范圍為糞便,，如果制定為檢測蔬菜的行標(biāo)就不合適；在沙門氏菌檢驗中低菌量樣品可以一步增菌。

（2）檢測項目決定選用方法,。例如：定量檢測的項目,，采用測試片、顯色培養(yǎng)基等方面,；致瀉性大腸桿菌,，采用PCR方法檢驗；金葡腸毒素,，采用免疫方法檢測,。

（3）樣品數(shù)量。樣品數(shù)量大,、建議采用免疫學(xué)方法,例如ELISA,。

（4）實驗室預(yù)算。預(yù)算少,，可以采用不需要儀器紙片法,、免疫學(xué)方法，預(yù)算多,，可選用全自動微生物檢測鑒定儀,、PCR等。

10,、企業(yè)如何通過實驗判定某個微生物快速檢測產(chǎn)品是否符合需求,？

首先，判定標(biāo)準(zhǔn)要從準(zhǔn)確度,、穩(wěn)定性,、操作是否方便等方面進(jìn)行測試。其次,，實驗又分定量實驗和定性試驗兩種,。定量實驗，跟國標(biāo)方法比對準(zhǔn)確率和使用便捷性,，設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)菌實驗和樣品實驗,，進(jìn)行計數(shù)比對，交叉反應(yīng)比對,，判定生長率,、特異性及穩(wěn)定性。定性試驗,，主要是致病菌檢測,，比度假陽性／陰性率及使用便捷性，設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)菌實驗和樣品添加實驗,，來判斷產(chǎn)品的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性,。此外，從驗證頻率上，建議每半年進(jìn)行一次比對驗證,，確定產(chǎn)品的穩(wěn)定性,；同時，建議同類產(chǎn)品選擇兩個以上品牌產(chǎn)品進(jìn)行使用,。

11,、熒光定量PCR、等溫PCR,、普通PCR的區(qū)別,？

實時熒光RT－PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實現(xiàn)實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,，并對起始模板進(jìn)行定量分析的方法,。普通PCR是借助DNA電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析。等溫PCR又稱環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)能在等溫（60~65℃）條件下,，短時間（通常是一小時內(nèi)）內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增,，是一種“簡便、快速,、精確,、低價”的基因擴(kuò)增方法（具體區(qū)別見表1）。

12,、食品中致病菌快速檢測是否需要前增菌,？是否必須增菌？

食品中致病菌檢測是否需要增菌要從檢測要求來看,，定量檢測的如金黃色葡萄球菌,、副溶血弧菌等，可以均質(zhì)后直接進(jìn)行檢測,。對于不得檢出的致病菌必須進(jìn)行增菌,。國標(biāo)對食品檢測樣本的要求：1CFU/25g，25g樣品中不允許1CFU,，樣品前處理后,，1CFU/25g+ 225mL，培養(yǎng)基=0.004CFU/mL,。再看幾種檢測方法的靈敏度：培養(yǎng)方法靈敏度均在103以上,，免疫方法靈敏度均在105以上，PCR方法靈敏度也要求在102以上,。食品樣本相對很干凈,，不增菌，是無法到達(dá)檢測靈敏度的,。

13,、目前提高食品中致病菌增菌效率的方法有哪些,？

增菌是檢測的前提,，增菌效果如何,，關(guān)系到靈敏度，對檢測至關(guān)重要,。如國標(biāo)方法,，沙門氏菌增菌需要至少兩天的時間，增菌時間長,，主要是菌體的復(fù)蘇,、生長和選擇性的問題。目前主要的增菌富集技術(shù)有：

（1）改良培養(yǎng)基成分和增菌方式,，通過改良培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)溫度,，讓菌體可以快速復(fù)式、生長,，提高選擇性,，可以在24小時之內(nèi)完成兩步增菌。

（2）免疫磁珠富集,，磁珠上的抗體與相應(yīng)的目標(biāo)致病菌的抗原物質(zhì)結(jié)合后,，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離,，而達(dá)到分離,、濃縮、純化目標(biāo)致病菌的目的,。

（3）噬菌體技術(shù),，利用噬菌體的專一性，通過噬菌體裂解殺死干擾菌,，從而是目標(biāo)菌株實現(xiàn)快速的增殖,。例如，在沙門氏菌的增菌過程中,，通過噬菌體特異性的裂解干擾的大腸桿菌,，從而實現(xiàn)沙門氏菌的快速、高濃度增殖,。

（4）膜過濾和層析技術(shù),，過濾法富集微生物是將適當(dāng)孔徑的濾膜放入濾器，過濾樣品,。由于濾膜的作用而將微生物滯留在膜表面,，使微生物與樣品溶液分開，達(dá)到微生物富集目的,。

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