一,、背景

曲霉屬通用PCR試劑盒是一種用于檢測(cè)曲霉屬病原體的生物試劑，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),。

曲霉屬通用PCR試劑盒具有高靈敏度,、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),，可用于科研實(shí)驗(yàn),、臨床檢測(cè)等領(lǐng)域。通過該試劑盒,，用戶可以快速,、準(zhǔn)確地檢測(cè)曲霉屬病原體，對(duì)于曲霉病的診斷和治療具有重要意義,。

曲霉屬通用PCR試劑盒是一種用于檢測(cè)曲霉屬真菌DNA的PCR試劑盒,。該試劑盒通常包括以下成分：

曲霉屬通用PCR試劑盒PCR反應(yīng)液：包括PCR緩沖液、dNTPs,、引物,、Taq聚合酶等。

標(biāo)準(zhǔn)品：用于定量檢測(cè)曲霉屬真菌DNA的濃度,。

陰性對(duì)照：用于排除假陽性結(jié)果的可能性,。

陽性對(duì)照：用于確認(rèn)試劑盒的準(zhǔn)確性和可靠性。

使用曲霉屬通用PCR試劑盒時(shí),，首先需要提取樣本中的DNA,，然后將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增。通過檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度,，可以確定樣本中是否存在曲霉屬真菌DNA,。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng),、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),，適用于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域。

二,、曲霉屬通用PCR試劑盒的操作步驟如下

1,、樣本采集：從患者體內(nèi)采集血液、糞便,、組織等樣本,，并將其保存在無菌容器中。

2,、DNA提?。簩⒉杉降臉颖具M(jìn)行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取試劑盒,。提取后的DNA應(yīng)保存在-20°C或更低的溫度下,。

3,、PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備：根據(jù)試劑盒說明書的要求，配制PCR反應(yīng)體系,，包括引物,、熒光探針、dNTPs,、DNA聚合酶等,。

4、PCR反應(yīng)：將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)體系中,，進(jìn)行PCR反應(yīng),。反應(yīng)條件和時(shí)間根據(jù)試劑盒說明書的要求進(jìn)行設(shè)置。

5,、結(jié)果分析：將PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè),，根據(jù)熒光信號(hào)的出現(xiàn)情況判斷是否存在曲霉屬的感染。

三,、應(yīng)用

曲霉屬通用PCR試劑盒可以用于15種中藥材表面污染真菌的分離鑒定及產(chǎn)毒性能分析：

通過對(duì)不同來源的15種45份中藥材表面污染真菌的分離鑒定,以及對(duì)菌株產(chǎn)毒性能進(jìn)行檢測(cè),探索一種中藥材表面污染真菌的快速鑒定方法,為全面了解中藥材真菌污染狀況,實(shí)現(xiàn)中藥材真菌毒素污染的預(yù)警報(bào)告奠定基礎(chǔ),。

方法：

1,、中藥材表面真菌的分離,、純化與培養(yǎng)利用平板稀釋法,對(duì)從廣西、湖南,、湖北三個(gè)地區(qū)的零售店購買的15種45份中藥飲片表面污染真菌進(jìn)行分離,、純化與培養(yǎng)。

2,、菌株的顯微鑒別利用乳酸酚棉藍(lán)染色法對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行顯微觀察,做初步的鑒定,。

3、真菌的分子鑒定選取文獻(xiàn)中常用的真菌鑒定通用引物ITS1/ITS4,以及自行設(shè)計(jì)的ITS引物Wen1F/Wen1R,、Wen2F/Wen2R,以分離到的菌株基因組DNA為模板,進(jìn)行曲霉屬通用PCR試劑盒PCR擴(kuò)增,獲得目的片段,測(cè)序并進(jìn)行序列比對(duì),。

4、菌株產(chǎn)毒性能的檢測(cè)根據(jù)顯微觀察和分子鑒定的結(jié)果以及有關(guān)參考文獻(xiàn),對(duì)部分菌株進(jìn)行液體培養(yǎng),采用LC-MS/MS方法對(duì)其培養(yǎng)物中的赭曲霉毒素A(OTA)及雜色曲霉毒素(ST)檢測(cè),。

結(jié)果：

1,、中藥材表面分離菌的情況及顯微鑒別結(jié)果在檢測(cè)的45份藥材中43份檢出有真菌污染,污染率達(dá)95%,真菌污染情況較為普遍。從實(shí)驗(yàn)的中藥材樣品表面共獲得143株真菌,經(jīng)過初步的形態(tài)學(xué)觀察主要為子囊菌類和半知菌類,其中曲霉屬(Aspergillus spp.),青霉屬(Penicillum spp.)數(shù)量最多,是所測(cè)樣品中的主要污染菌屬,。湖北樣品中共分離到真菌44株,其中曲霉屬17株,占38%,青霉屬5株,占11%,；湖南樣品中共分離到真菌42株,曲霉屬12株,占28%,青霉屬10株,占23%；廣西樣品中共分離到真菌57株,曲霉屬15株,占26%,青霉屬19株,占33%,。

2,、曲霉屬通用PCR試劑盒分子鑒定結(jié)果利用基于ITS序列的分子鑒定方法對(duì)所得的143株真菌進(jìn)行鑒定,117株鑒定到屬以上。曲霉屬共39株,其中雜色曲霉(Aspergillus versicolor)7株,煙曲霉(Aspergillus fumigatus)4株,黃曲霉(Aspergillus fiavus)和棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)各3株,；青霉屬共34株,；枝孢菌屬(Cladosporium spp.)10株,；散囊菌屬(Eurotium spp.)5株；小光殼屬(Leptosphaerulina spp.)3株,、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)3株,；擬青霉屬(Paceilomyces spp.)2株；鏈格孢屬(Alternaria spp.)2株,；炭團(tuán)屬(Hypoxylon spp.)2株,；其他菌屬17株；另有26株菌株未能準(zhǔn)確分類,。

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