一、背景

細胞輻照培養(yǎng)實驗服務(wù)是細胞實驗平臺常見實驗之一,，需由經(jīng)驗豐富的實驗人員進行操作,。

細胞輻照指的是用X射線,，β、γ射線等電離射線來輻射細胞的過程,。放射治療作為治療腫瘤的重要手段,，廣泛應用于各種腫瘤的治療，具有療效確切,，副作用小等優(yōu)點,。然而在腫瘤進行放射治療時，射線在殺死腫瘤細胞的同時,，不可避免的對腫瘤周圍正常組織,、器官也產(chǎn)生一定的損傷。

為了提高放療對腫瘤的療效,，減少射線對正常組織,、器官的損傷，需要尋找一些輔助腫瘤治療的藥物,。細胞輻照有利于在體外摸索的輻射強度,，也在輻射增敏劑的研究中具有重要作用。此外,，細胞輻照還可應用于細胞損傷的研究,。

二、實驗技術(shù)原理

輻射會延長細胞周期,，誘導染色體畸變,，從而使組織、細胞受到損傷,。

三,、實驗操作流程

1、細胞培養(yǎng)

2,、用指定的藥物處理細胞

3,、待細胞狀態(tài)良好時，不同劑量的射線照射細胞

4,、輻照細胞的培養(yǎng)

四,、應用

用于小鼠成骨細胞受X線輻照后培養(yǎng)上清液的蛋白芯片分析研究：

通過觀察不同劑量輻照對成骨細胞增殖分化及其分泌蛋白的影響,篩選輻射損傷可能的特異性蛋白并初步探討可能涉及的生物學過程及信號轉(zhuǎn)導通路,為更好地理解輻射對骨組織的生物學作用提供參考。

方法：

1,、取體外培養(yǎng)的小鼠成骨細胞MC3T3-E1,按輻照劑量分成0 Gy組,、2 Gy組、4 Gy組,、8 Gy組,、16 Gy組5組,使用6 MV直線加速器分別予以X線輻照,觀察輻照后細胞形態(tài)的改變,CCK8法檢測細胞增殖情況,輻照后7 d檢測0 Gy組,、2 Gy組,、4 Gy組、8 Gy組細胞內(nèi)ALP活性及采用qPCR檢測細胞OPG、OCN,、Runx2,、ALP的mRNA表達水平。

2,、小鼠成骨細胞輻照后7 d分別收集0 Gy組,、2 Gy組、4 Gy組,、8 Gy組細胞上清液,采用高通量蛋白芯片技術(shù)檢測分泌蛋白的表達情況,GO和KEGG pathway分析差異蛋白的生物學信息,并篩選出輻射劑量依賴性上調(diào)的差異蛋白,通過ELISA驗證,。

結(jié)果：

1、輻照后成骨細胞胞體腫大,細胞核變大,胞漿內(nèi)空泡增多,特別是核區(qū)附近出現(xiàn)黑色顆粒,貼壁能力減退,出現(xiàn)較多漂浮的細胞,隨著輻射劑量增加,上述改變愈加明顯,。采用CCK8法檢測細胞增殖情況,輻照后3 d,、5 d和7 d,4個輻照組均導致成骨細胞增殖呈輻射劑量依賴性降低（P<0.05）。輻照后7 d,各輻照組細胞內(nèi)ALP活性均較對照組低,差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）,。2 Gy輻照未顯著引起成骨相關(guān)基因mRNA表達水平的變化;4 Gy以上輻照組較對照組OPG,、Runx2和ALP基因的表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;而OCN基因的表達水平在4 Gy輻照時下調(diào),8 Gy輻照時顯著上調(diào)（P<0.05）。

2,、成骨細胞輻照后上清液中共發(fā)現(xiàn)36個表達差異蛋白,GO及KEGG Pathway分析表明X線輻照成骨細胞后,多種炎癥細胞及免疫細胞被激活,細胞增殖,、分化、遷移,、趨化能力增強,細胞因子-細胞因子受體相互作用,、細胞黏附信號、血管生成信號,、TNF信號通路,、JAK/STAT信號通路、ERK1和ERK2信號通路,、IL-17信號通路等明顯富集,。其中IL-22和TremL1的表達水平在3個輻射劑量下都存在差異,并且均表現(xiàn)為上調(diào)。RANTES呈輻射劑量依賴性表達上調(diào),ELISA驗證成骨細胞輻照后RANTES表達水平顯著上調(diào)（P<0.05）,。

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