不知道大家是否會遇到細胞凍存的時候狀態(tài)非常不錯,結(jié)果等到需要用到該細胞的時候怎么也復(fù)蘇不起來的情況???或許可能是凍存細胞的時候出現(xiàn)了什么差錯?
一.細胞凍存的原則:慢凍,細胞在冷凍過程中,,如果降溫過快,,會形成大的冰晶,這些冰晶會破壞細胞結(jié)構(gòu),,導(dǎo)致細胞死亡,。
詳細版本見《細胞凍存的原理是什么,?》
二.凍存液的配置:
常用配置比例:培養(yǎng)基:血清:DMSO=7:2:1
適用于大多數(shù)細胞系,能夠保證細胞在凍存過程中有較高的存活率,。
血清:DMSO=9:1
適用范圍:適用于需要長時間保存或者具有特別珍貴性的細胞系,。血清含量高,可以更好地保護細胞,,并確保其在凍存后依然保持較好的生物學特性,。
無血清凍存液:適用于某些對血清敏感或需要避免血清成分的細胞系。配置比例:如10% DMSO+90%專用無血清培養(yǎng)基,,或其他適合細胞生長的無血清替代品,。
凍存注意事項!??!
詳細版本見《細胞凍存的注意事項》
1.不要將DMSO直接加入含有細胞的培養(yǎng)基中,因為DMSO溶于培養(yǎng)基時會釋放大量熱量,,可能燙傷細胞,。在加入細胞前,可以將配置好的凍存液放于4℃進行預(yù)冷(預(yù)冷步驟并非必需),。DMSO在4°C時毒性會大大減弱,且滲透速度加快,,有助于保護細胞,。
2.若使用凍存盒進行凍存,必須將凍存盒解凍至室溫(避免溫度驟變對細胞的損傷:如果直接將冷凍的凍存盒從低溫環(huán)境取出,,并立即打開或處理,,細胞會受到溫度驟變的影響。
溫度的急劇上升可能導(dǎo)致細胞內(nèi)冰晶的形成或擴大,,對細胞膜和細胞器造成機械性損傷,,進而影響細胞的存活率。)
3.把握細胞凍存的密度:應(yīng)確保細胞處于對數(shù)生長期,,形態(tài)正常,,無污染,且細胞密度足夠大,,因為凍存和復(fù)蘇的過程中不可避免會導(dǎo)致部分細胞死亡,。
細胞凍存的步驟:
詳細版本見《細胞凍存的實驗步驟》
1.配置好細胞凍存液,置于4℃預(yù)冷備用
2.將待凍存的細胞從培養(yǎng)箱中取出,,棄去舊的培養(yǎng)基,,PBS洗滌,對于貼壁細胞,,加入適量胰酶消化液,,將培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱中消化數(shù)分鐘(消化時間根據(jù)細胞類型而定)當觀察到細胞大塊大塊地從皿底脫落時,,加入等體積的wan全培養(yǎng)基終止消化。離心收集細胞,;對于懸浮細胞直接離心收集
3.向離心管中加入適量的凍存液,,用移液器輕輕吹打細胞沉淀,使細胞均勻懸浮于凍存液中,。
4.將重懸后的細胞懸液分裝至無菌凍存管中,,凍存管放入-80過夜,次日轉(zhuǎn)移置液氮保存,。
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