自噬的研究背景

關(guān)于自噬的研究曾獲得過(guò)兩次諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。是比利時(shí)科學(xué)家克里斯汀·德·迪夫(Christian de Duve)因發(fā)現(xiàn)了在細(xì)胞自噬機(jī)制中起到重要作用的溶酶體,，獲得1974年諾貝爾獎(jiǎng),；其次是日本大隅良典團(tuán)隊(duì)因探明了細(xì)胞自噬的啟動(dòng)機(jī)制，獲得2016年諾貝爾獎(jiǎng)。2023年,，國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)揭曉的今年國(guó)自然評(píng)審結(jié)果,，自噬相關(guān)研究的中標(biāo)數(shù)量超500項(xiàng)（來(lái)源：ZCOOL國(guó)自然項(xiàng)目查詢(xún)系統(tǒng)）！

圖1 自噬研究進(jìn)程

什么是自噬,？

自噬是細(xì)胞在相關(guān)基因(autophagy related gene,，Atg)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程，以此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新,，是真核細(xì)胞的生命現(xiàn)象,。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是細(xì)胞自己吃自己、廢物再利用,。自噬現(xiàn)象在機(jī)體的生理和病理過(guò)程中都會(huì)發(fā)生,，常見(jiàn)的病理誘導(dǎo)因素包括：營(yíng)養(yǎng)缺乏、能量代謝異常,、缺血,、缺氧、病原體感染等,。

細(xì)胞自噬主要有三種形式：微自噬(microautophagy),、巨自噬(macroautophagy，通常也稱(chēng)作自噬)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediated autophagy,，CMA),，它們的主要不同之處在于產(chǎn)物（貨物）進(jìn)入溶酶體的分子途徑（圖2）。

圖2 三種自噬途徑^[1]

在分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)中,，具有KFERQ樣基序的蛋白質(zhì)在Hsp70伴侶的幫助下通過(guò)LAMP-2A轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中,。微自噬(microautophagy)涉及通過(guò)內(nèi)陷溶酶體膜來(lái)隔離底物，而在巨自噬(macroautophagy)中,，底物被吞噬在稱(chēng)為自噬小體的雙層膜小泡中,，自噬小體隨后與溶酶小體融合，提供其內(nèi)容物以供降解,。

自噬相關(guān)信號(hào)通路及關(guān)鍵蛋白

自噬過(guò)程受到不同自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,，ATG)的調(diào)控, 據(jù)報(bào)道目前大約已有40個(gè)在酵母和哺乳動(dòng)物中高度保守的自噬相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)。自噬發(fā)生需要經(jīng)過(guò)以下幾個(gè)階段：自噬前體形成,、自噬前體延長(zhǎng)包裹自噬的底物形成自噬泡(Phagophore),、細(xì)長(zhǎng)自噬泡關(guān)閉形成自噬體(Autophagosome)、自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體(Autolysosome)完成底物降解,。

圖3 自噬過(guò)程^[2]

典型的自噬（巨自噬）如圖3所示,，在營(yíng)養(yǎng)缺乏等應(yīng)激情況下，AMPK的激活或mTOR的抑制導(dǎo)致ULK的激活,，ULK使Beclin-1磷酸化,，導(dǎo)致VPS34的激活和吞噬細(xì)胞的形成,。ULK在與FIP200和ATG13的復(fù)合體中發(fā)揮作用，而VPS34的功能需要一個(gè)調(diào)節(jié)亞基VPS15(P150)和Beclin-1,，后者進(jìn)一步調(diào)節(jié)其他調(diào)節(jié)因子如AMBRA,、ATG14、UVRAG和BIF-1的聯(lián)系,。多種ATG蛋白,，如ATG5和ATG7，構(gòu)成了兩個(gè)“泛素樣結(jié)合系統(tǒng)”,，它們催化形成磷脂酰乙醇胺(PE)連接的LC3(LC3-II)，并將其正確地結(jié)合到吞噬體膜上,。細(xì)長(zhǎng)自噬泡的關(guān)閉標(biāo)志著成熟自噬體的形成,，自噬體最終與溶酶體融合，導(dǎo)致貨物降解,、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的循環(huán),。

表1自噬不同階段關(guān)鍵蛋白及作用

細(xì)胞自噬研究策略

1、電鏡觀察自噬體的形成——自噬檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)r

自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),，需要使用透射電子顯微鏡觀察自噬體的形態(tài),。電鏡檢測(cè)自噬主要是基于辨認(rèn)自噬體結(jié)構(gòu)特征（表2）。

表2 自噬不同階段形態(tài)特征

依照上述描述,，能夠確認(rèn)大部分自噬性囊泡，但有以下問(wèn)題需要注意：

1）是否存在雙層或多層膜不能作為識(shí)別自噬體的依據(jù)（普通透射電鏡切片在制備過(guò)程中的處理可影響膜脂質(zhì)成分,，切片上的自噬體并非都是兩層膜結(jié)構(gòu),，可能僅有一層膜,，也可能是多層膜，有時(shí)膜結(jié)構(gòu)可能因?yàn)橹|(zhì)被提取而無(wú)法辨認(rèn)）,；
2）線(xiàn)粒體也含雙層膜,，腫脹或含有沉淀物的線(xiàn)粒體外觀與自噬體形態(tài)相似，但仔細(xì)觀察,，線(xiàn)粒體雙層膜間距一般較小且均一,，線(xiàn)粒體內(nèi)膜折疊形成嵴，而自噬體內(nèi)膜不會(huì)折疊,；
3）粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有時(shí)會(huì)包繞線(xiàn)粒體等細(xì)胞器,，容易誤認(rèn)為自噬體，根據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有核糖體而自噬體膜上無(wú)核糖體可鑒別,；
4）切片上的電子密度低或空泡有時(shí)也會(huì)被誤認(rèn)為自噬囊泡,。

2、Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白

在進(jìn)行自噬研究時(shí),，提取蛋白進(jìn)行Western Blot，檢測(cè)LC3-I和LC3-II幾乎是必做的實(shí)驗(yàn),。細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,。LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ，分布于細(xì)胞漿內(nèi),。當(dāng)自噬體形成后,，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，并穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合,。因此,，LC3-Ⅱ被用來(lái)作為自噬體的標(biāo)記，其表達(dá)水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量^[3],。LC3-I/II的形成和降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,，瞬時(shí)LC3-Ⅱ表達(dá)不能反映自噬程度，需配合使用工具化合物分析自噬變化,。

除了檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的轉(zhuǎn)換(LC3-II/LC3-I)外,，還可以用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Beclin1、P62等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,。Western blot操作包括：總蛋白提取→蛋白含量測(cè)定→SDS-PAGE電泳→電轉(zhuǎn)→封閉→抗體孵育→化學(xué)發(fā)光成像,。就操作難度而言，Western blot在一眾實(shí)驗(yàn)中排名靠前,，WB實(shí)驗(yàn)具體步驟可參考我們往期分享,。

3、自噬的實(shí)驗(yàn)性調(diào)控——工具化合物

通過(guò)人為的干預(yù)來(lái)激活或者抑制自噬功能后觀察細(xì)胞行為或效應(yīng)分子的變化能夠使研究結(jié)論更具有說(shuō)服力,。目前,，常用的抑制自噬及誘導(dǎo)自噬的藥物及機(jī)制如表3所示,。需要注意的是，這些工具藥普遍存在的缺陷就是特異性不強(qiáng),，在抑制自噬的同時(shí)對(duì)細(xì)胞其他代謝過(guò)程也可能會(huì)有影響,。如3-MA抑制ClassⅢ PI3K的同時(shí)對(duì)ClassⅠ PI3K同樣也有抑制作用，繼而抑制Akt/mTOR通路,，激活自噬,。

表3 細(xì)胞自噬常用的激活劑和抑制劑

4、應(yīng)用 GFP-LC3 轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)現(xiàn)體內(nèi)自噬的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

Tian等^[4]利用GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠,，借助于體內(nèi)成像技術(shù)經(jīng)顱骨檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性腦卒中后缺血腦組織區(qū)域GFP熒光強(qiáng)度,，與體外自噬成像、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)檢測(cè),、蛋白印跡分析,、免疫組織化學(xué)、免疫熒光等分析方法結(jié)果相似,。該研究提供了活體自噬檢測(cè)的證據(jù),，展示了一種在活體動(dòng)物模型中檢測(cè)體內(nèi)自噬的方法，此方法對(duì)監(jiān)測(cè)活體中風(fēng)患者體內(nèi)的自噬過(guò)程以及闡明自噬在腦缺血和其他神經(jīng)疾病中的詳細(xì)作用具有重要價(jià)值,。

圖4 腦缺血區(qū)頭部活體成像監(jiān)測(cè)GFP熒光信號(hào)

自噬研究已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn),，揭示自噬的發(fā)生機(jī)制、自噬與疾病發(fā)生的關(guān)系對(duì)預(yù)防與治療多種人類(lèi)重大疾病具有重要意義,。然而,，至今并沒(méi)有非常準(zhǔn)確可靠的自噬功能檢測(cè)和監(jiān)控方法，我們?cè)谶M(jìn)行自噬相關(guān)研究時(shí)應(yīng)結(jié)合不同的檢測(cè)原理,，借助不同的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分析,，體內(nèi)外結(jié)果互相驗(yàn)證以避免單一技術(shù)的局限性。

[1] Duraes F V , Jennifer N , Juan D ,et al.Macroautophagy in Endogenous Processing of Self- andPathogen-Derived Antigens for MHC Class II Presentation[J].Frontiers in Immunology, 2015, 6. DOI:10.3389/fimmu.2015.00459.
[2] Michelle Cicchini; Vassiliki Karantza; Bing Xia.Molecular Pathways: Autophagy in Cancer-A Matter of Timing and Context[J].Clinical Cancer Research.2015,21 (3): 498-
[3] Kimura S, Fujita N, Noda T, et al. Monitoring autophagy inmammalian cultured cells through the dynamics of LC3. Methods Enzymol, 2009, 452: 1-12.

[4] Tian F, Deguchi K, Yamashita T, et al. In vivo imaging of autophagy in a mouse stroke model. Autophagy, 2010, 6(8): 1107-1114.

自噬激活劑：

自噬抑制劑：

自噬相關(guān)抗體：

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Absin特色產(chǎn)品線(xiàn)：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液,、預(yù)染marker、預(yù)制膠,；IHC相關(guān)：二抗試劑盒,、組化筆；IP/CoIP試劑盒,；激動(dòng)劑/抑制劑,；血清、BSA,、蛋白酶K,、CTB、TTX,、CEE,；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒,；ELISA試劑盒,；重組蛋白；抗體: 二抗,、標(biāo)簽抗體,、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...