蛋白樣品制備的注意事項：

1,、細(xì)胞數(shù)量達(dá)5×106

2、將細(xì)胞裂解液再離心,，收集上清液,，加loading煮樣5min。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項：

1,、做膠：防止漏膠,、進氣泡以及花膠（水封、插梳子和拔梳子）

2,、加樣：兩邊加loading,，加樣量一樣，加樣時間要盡量短,，以免樣品擴散,。

3、電泳：將膠夾好放于電泳槽中,，加電泳buffer（內(nèi)外面不能聯(lián)通）,，將電壓調(diào)到90V開始電泳。

轉(zhuǎn)膜注意事項：

1,、泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿,、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min,。（1.凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡,，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形,。2.PVDF膜具有疏水性,，需用甲醇浸泡）

2、轉(zhuǎn)膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板

3,、轉(zhuǎn)膜條件：0.35A 250V 1h40min 冰浴中進行轉(zhuǎn)膜（具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,；目的蛋白的分子量越大,，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短）

4,、避免直接用手碰雜交膜,，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉,。

5,、夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在,，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不*,。

6、保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣,，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率,。

7、雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強的結(jié)合能力,，從而產(chǎn)生較高的背景,，故如果選擇雞來源的抗體使用硝酸纖維素膜（NC膜）

關(guān)于磷酸化蛋白檢測的注意事項：

1、保持待測蛋白處于磷酸化狀態(tài),！在標(biāo)本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑（NaF,，可以防止去磷酸化），并將標(biāo)本時刻保持在冰浴中,！

2,、使用5%的BSA作為封閉試劑！不能使用脫脂奶粉?。ㄒ驗槊撝谭壑泻欣业鞍?，會出現(xiàn)很高的背景）。

抗體保存注意事項：

1,、收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝盒保存,！

2、對于大部分抗體,，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

  2.1 分裝的量以一次實驗用完為好,，少不能少于10μl每份。因為分裝體積越小,，抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響,。

  2.2 復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃,，避免再凍起來,！

  2.3 避免將抗體保存在自動除霜冰箱中,。

3,、大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的,。

4、長期保存,，加入疊氮鈉,，防止細(xì)菌污染。