免疫熒光實驗?原理

將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后,，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應,。

免疫熒光實驗流程

單標記方法

免疫熒光單標記是指只標記一種蛋白質分子，方法比較簡單,，只要按照染色步驟去做,，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇,，固定液選擇的合適與否,，可能會直接影響染色結果。具體染色方法如下,。

1,、所需材料與試劑

a, 培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達到60%-70%的細胞。

b, 一抗,、FITC或TRITC標記的二抗,。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預冷20 min)。

d, 封閉液,。

e, 0.01mol／LPBS緩沖液,。

2、染色方法

a, 取出培養(yǎng)有細胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿,，用0.01MPBS洗2-3遍,。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d,，正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min,，抑制IgG的非特異性結合。阻斷血清選擇與二抗同一種屬的正常血清,。

e, 去掉正常血清,，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃過夜,?？贵w以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經試驗而定)。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min,，0.01 mol/IPBS洗5 min,，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain,。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗,，37℃,，孵育1h,。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain,，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min,，0.01mol/LPBS洗5 min,，用濾紙吸干。

i, 90%甘油(PBS配制)封片,。

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察,，或于4℃避光保存。

雙標記方法

免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內兩種蛋白質分子,，當懷疑某種配體與已知受體結合后可用此方法加以證明,。此方法稍微復雜一些，應注意所用的一抗是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體,，來自家兔,；B抗體為單克隆抗體，來自小鼠),。其次,，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應重疊，且盡量遠離,，通?？梢赃x擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC,、FITC和Cy5,，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下,，染色時兩種一抗可以同時孵育,，然后可以同時孵育兩種二抗。但當染色結果一種顏色非常弱,，而另一種顏色比較強時,，應考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同**熒光單標記,。

客戶提供

細胞株或細胞爬片,。注：細胞爬片不宜太密；細胞固定,。組織切片,，一抗

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基本實驗步驟、藥品,、樣品處理,、圖片及圖片分析,，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝

實驗周期：1-3周