苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

細胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,，在外源物質代謝中具有重要作用,，尤其是藥物和毒物的代謝。AH 在P450 酶系中相當于CYP2E1 亞型,，CYP2E1 不僅參與了藥物的代謝,，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。

測定原理：

AH 催化苯胺羥化后產生的 4-氨基酚,，進一步轉變?yōu)榉?/span>-吲哚復合物,，在 630nm 處有特征吸收峰；通過測定 630nm 吸光度增加速率,，來計算AH 活性,。

苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存,。臨用前加入 100ml 蒸餾水,，充分溶解。試劑三：粉劑×1 瓶,，4℃保存,。臨用前加入 10ml 蒸餾水，充分溶解,。試劑四：粉劑×1 瓶,，4℃保存。臨用前加入 5ml 蒸餾水,，充分溶解,。

試劑六：粉劑×1 瓶（腐蝕性試劑），4℃避光保存,。臨用前加入 10ml 蒸餾水,，充分溶解,。試劑七：粉劑×1 瓶，4℃保存,。臨用前加入 10ml 蒸餾水充分溶解,。

標準液：液體×1 瓶，10μmol/L,，4℃避光保存,。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

自備儀器和用品：

普通離心機、超速離心機,、可見分光光度計/酶標儀,、微量玻璃比色皿/96 孔板、雙蒸水和冰,。

粗酶液提?。?/span>

1、除去細胞核,，線粒體等大分子物質：稱約 0.5g 組織,，加入 1ml 試劑一，冰上充分研磨,，10 000g 4℃，離心 30min,，取上清液,，轉移到超速離心管中。

2,、粗制微粒體： 100 000g 4℃,，離心 60min，棄上清液,。

3,、除血紅蛋白等雜質：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解,，100 000g 離心 30min,，棄

上清液。

4,、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml,，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液,，待測,。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min，調節(jié)波長到 630 nm,，蒸餾水調零,。

2. 試劑三置于 37℃水浴中預熱 30min,。

3. 試劑五置于冰浴預冷 30min。

4. 標準管：取 0.5 ml EP 管,，加入 100μl 標準液,，100μl 試劑六，100μl 試劑七,，混勻后室溫靜置 30min,，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 測定光吸收,，記為A 標準管,。

5. 對照管：取 0.5 ml EP 管，加入 50μl 粗酶液,，100μl 試劑三,，50μl 蒸餾水，混勻后 37℃水浴中保溫 30min,；

再加入 100μl 試劑五,，混勻后冰浴 5min，11000rpm,，4℃,，離心 10min；取 100μl 上清液,，加入新的 0.5 ml EP 管,；再加入 100μl 試劑六，100μl 試劑七,，混勻后室溫靜置 30min,，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 測定光吸收,，記為 A 對照管,。

6. 測定管：取 0.5 ml EP 管，加入 50μl 粗酶液,，100μl 試劑三,，50μl 試劑四，混勻后 37℃水浴中保溫 30min,；

再加入 100μl 試劑五,，混勻后冰浴 5min，11000rpm,，4℃,，離心 10min；取 100μl 上清液,，加入新的 0.5 ml EP 管,；再加入 100μl 試劑六,，100μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min,，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板,，630 nm 測定光吸收，記為 A 測定管,。

AH 活性計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位,。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍數÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷Cpr。

（2） 按樣本質量計算

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位,。

AH 活性(nmol/min/g 鮮重)= C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍數÷(W×V 樣)÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷W

C 標準品：10μmol/L,；V 標準品：100μl=1×10^-4L；稀釋倍數： V 反總÷V 上清液=300μl÷100μl=3,；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/ml）,，需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒,；W ：樣品質量,；V 樣：加入反應體系中粗酶液體積， 50μl=0.05 ml,； T：催化反應時間（min）,，30min。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位,。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍數÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷Cpr

（2） 按樣本質量計算

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位,。

AH 活性(nmol/min/g 鮮重) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管×稀釋倍數÷(W×V 樣)÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標準管÷W

C 標準品：10μmol/L；V 標準品：100μl=1×10^-4L,；稀釋倍數：V 反總÷V 上清液=300μl÷100μl=3；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/ml）,，需要另外測定,，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒； W ：樣品質量,； V 樣：加入反應體系中粗酶液體積,， 50μl=0.05 ml； T：催化反應時間（min）,，30min,。

苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒