中性蛋bai酶（Neutral protease, NP）活性測定試劑盒說明書

微量法 100T/48S

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

NP 在一定的溫度和中性pH 條件下,，催化水解蛋白質(zhì),。由于其安全無毒、水解能力強,、作用范圍廣等特點,，中性蛋bai酶常用于食品、飼料,、化妝品和營養(yǎng)保健品生產(chǎn),。

測定原理：

中性條件下，NP 催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪an酸,；在堿性條件下,，酪an酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍；在 680nm 有特征吸收峰,。

中性蛋bai酶活性測定試劑盒   離子系列

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶,，4℃保存,。臨用前加 4ml 蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1 瓶,，4℃避光保存,。臨用前加入 10ml 試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解,。（可在燒杯上蓋一層保鮮膜,，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā),，一般加熱 15-30 分鐘,，該試劑為過飽和試劑，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用）,。

試劑四：粉劑×1 瓶,， 4℃保存。臨用前加 20ml 蒸餾水溶解,。

標準品：液體 1ml×1 支,，0.25μmol/ml 標準酪an酸溶液，4℃保存,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀,、微量玻璃比色皿/96 孔板、水浴鍋,、磁力攪拌器,、可調(diào)式移液槍、1.5 ml EP管和蒸餾水,。

粗酶液提取：

1,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）冰浴勻漿,，8000g,，4℃離心 10min，取上清,，即粗酶液,。

2、血清或培養(yǎng)液：直接測定,。

3,、細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 試劑一）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w,，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）,；然后 8000g,， 4℃，離心 10min,，取上清置于冰上待測。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預(yù)熱 30min,，調(diào)節(jié)波長到 680 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二,、試劑三和試劑四置于 30℃水浴保溫 30min,。

3. 對照管：取 0.5 ml EP 管，加入 20μl 粗酶液,，40μl 試劑二,，混勻后置于 30℃水浴保溫 10min；加入 40μl試劑三,，混勻后 8000g,，4℃離心 10min；取 40μl 上清液,，加入新的EP 管,，再加入 200μl 試劑四，40μl 試劑五,，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min,，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于 680nm 測定光吸收,，記為A 對照管,。

4. 測定管：取 0.5 ml EP 管,，加入 20μl 粗酶液,，40μl 試劑三，混勻后置于 30℃水浴保溫 10min,；加入 40μl試劑二,，混勻后 8000g， 4℃離心 10min,；取 40μl 上清液,，加入新的EP 管，再加入 200μl 試劑四,，40μl試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板,，于 680nm 測定光吸收,，記為A 測定管。（注意與空白管不同,，先加試劑三，后加試劑二）

5. 空白管：取 0.5 ml EP 管,，加入 40μl 蒸餾水，200μl 試劑四,，40μl 試劑五,，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板,，于 680nm 測定光吸收,，記為A 空白管。

6. 標準管：取 0.5 ml EP 管,，加入 40μl 標準品，200μl 試劑四,，40μl 試劑五,，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板,，于 680nm 測定光吸收,，記為A 標準管。

注意：空白管和標準管只需要測定一次,。計算公式：

1. 按照樣本蛋白濃度計算

NP 活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生 1nmol 酪an酸為 1 個酶活單位,。

NP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×V 反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷Cpr 2．按照樣本質(zhì)量計算

NP 活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1 nmol 酪an酸為 1 個酶活單位。

NP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×V 反總÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷W

3. 按照液體體積計算

NP 活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪an酸為 1 個酶活單位,。

NP 活性（nmol/min/ml）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×V 反總÷V1÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）

1.  按照細胞數(shù)量計算

NP 活性單位定義：30℃每 10⁴ 個細胞每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪an酸為 1 個酶活單位,。

NP 活性（nmol/min /10⁴ cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×V 反總÷（細胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷細胞數(shù)量

C 標準品：0.25 μ mol/ml 標準酪an酸溶液；V 反總：酶促反應(yīng)總體積,，0.1ml,；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）； V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（ml）,，0.02 ml,；V2：提取液總體積（ml）,，1ml；T：催化反應(yīng)時間（min）,， 10min,；W：樣品質(zhì)量（g）。

注意事項：

臨用前配制的試劑配制好后 4℃保存,，并且 3 天內(nèi)使用完畢,。

中性蛋bai酶活性測定試劑盒   離子系列