谷胱gan肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

GR 是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱gan肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲中 GR 被TrxR 取代）。GR 催化NADPH 還原GSSG 生成GSH,，有助于維持體內(nèi) GSH/GSSG比值。GR 在氧化脅迫反應(yīng)中對活性氧清除起關(guān)鍵作用,，此外GR 還參與抗壞血酸－谷胱gan肽循環(huán)途徑,。

測定原理：

GR 能催化NADPH 還原GSSG 再生GSH，同時NADPH 脫氫生成NADP⁺,；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰,，相反NADP⁺在該波長無吸收峰；通過測定 340 nm 吸光度下降速率來測定 NADPH 脫氫速率,，從而計(jì)算GR 活性,。

谷胱gan肽還原酶（GR）活性測定試劑盒

組成：

試劑二：粉劑×2 支，-20℃保存,。臨用前加入 1.2ml 蒸餾水，混勻,。試劑三：粉劑×2 支,，-20℃保存。臨用前加入 0.6ml 蒸餾水,，混勻,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋,、移液器,、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板,、和蒸餾水

粗酶液提?。?/span>

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g,，4℃離心 15min，取上清,，置冰上待測,。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml 試劑一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w,，超聲 3 秒,，間隔 7 秒，總時間 3min）,；然后 8000g,， 4℃，離心 15min,，取上清置于冰上待測,。

3. 血清等液體：直接測定。

操作步驟：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min,，調(diào)節(jié)波長到 340 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一置于 25℃（普通物質(zhì)）或者 37℃（哺乳動物）中預(yù)熱 30min,。

3. 測定管：取微量石英比色皿或 96 孔板,，依次加入 10μl 試劑三，20μl 試劑二,，150μl 試劑一,，20μl 上清液，混勻,，于 340nm 迅速測定初始吸光度和 180 s 吸光度,，記為 A 測 1 和A 測 2，△A 測定管= A 測 1﹣A測 2,。

注意：

1,、加完上清液后必須迅速混勻測定，保證準(zhǔn)確測出初始反應(yīng)速度,；

2,、當(dāng)出現(xiàn)初始 180s 內(nèi)吸光值不穩(wěn)定時，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間,，選取相對穩(wěn)定的時間段內(nèi)吸光值變化值,；

3、當(dāng)所測△A 測定管的值在零點(diǎn)附近徘徊時,，可能原因：（1）樣本GR 酶活性低,，建議濃縮樣本后再進(jìn)行測定；（2）樣本GR 酶活性過高,，吸光值變化區(qū)間過小無法準(zhǔn)確測出,，建議樣本稀釋 2~5 倍后再進(jìn)行測定

計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下,，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位,。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷[Cpr×V 樣]÷T

= 536×△A 測定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每克樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位,。

GR 酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 536×△A 測定管÷W

(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中,，pH8.0 條件下，每 10⁴ 個細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位,。

GR 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 536×△A 測定管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中,，pH8.0 條件下，每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位,。

GR 酶活(nmol/min/ml)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷×V 樣÷T

= 536×△A 測定管

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù) 6.22×10³L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1 cm,；V 反總：反應(yīng)體系總體積,，200μl=2×10^-4 L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol,； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/ml）,；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，20μl =2×10^-2 ml,；V 樣總：提取液體積，1 ml,；V 樣總：提取液體積,，1 ml；T：反應(yīng)時間,，3 min,。 b.使用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下,，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷[Cpr×V 樣]÷T

= 1072×△A 測定管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中,，pH8.0 條件下,，每克樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 1072×△A 測定管÷W

(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中,，pH8.0 條件下,，每 10⁴ 個細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ △A 測定管÷ε÷d×V 反總×10⁹] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=1072×△A 測定管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在一定溫度中,，pH8.0 條件下,，每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/ml)= [ (△A 測定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷×V 樣÷T

=1072×△A 測定管

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù) 6.22×10³L/mol/cm,；d：96 孔板光徑,，0.5 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，200μl=2×10^-4 L,；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol,； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/ml）；W ：樣品質(zhì)量,；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，20μl =2×10^-2 ml；V 樣總：提取液體積,，1 ml,；V 樣總：提取液體積，1 ml,；T：反應(yīng)時間,，3 min。

注意事項(xiàng)：

（1） 樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行,，且須在當(dāng)日測定酶活力,，勻漿液避免反復(fù)凍融；

（2） 試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用,，配制完后,，置于冰上，未使用完的 4℃保存,，三天內(nèi)使用完,。

（3） 測定前須先用 1～2 個樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，哺乳動物組織一般須用試劑一稀釋 2～5 倍,。

（4） 細(xì)胞中 GR 活性測定時,，細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細(xì)胞中 GR 的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理,，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞,。

谷胱gan肽還原酶（GR）活性測定試劑盒