NADP-蘋果酸酶（Malic enzyme ,，NADP-ME）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

ME 廣泛存在于微生物,、培養(yǎng)細胞、動物和植物胞漿中,，尤其在植物組織中活性較高,。ME 催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和CO2,，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng),，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。 ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān),。近年來植物 ME 活性測定較多,，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點。根據(jù)輔酶專一性和對底物特異性的不同,，可將ME 分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40),。

測定原理：

NADP-ME 催化NADP+還原成 NADPH，在 340nm 下測定NADPH 增加速率,。

NADP-蘋果酸酶試劑盒 輔酶Ⅱ系列

組成：

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

試劑二：粉劑×1 瓶,，-20℃保存； 臨用前加入 20ml 試劑一充分振蕩,，溶解待用,，用不完的試劑分裝后-20度保存，禁止反復(fù)凍融,。

試劑三：粉劑×1 瓶,，-20℃保存；臨用前加入 2.5ml 蒸餾水充分振蕩,，溶解待用,，用不完的試劑分裝后-20度保存,，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、水浴鍋,、臺式離心機、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板和蒸餾水,。

樣本的前處理：

1、細菌,、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）；14000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液）,，進行冰浴勻漿。14000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測,。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本和 170μl 試劑二,，混勻，30℃孵育 5min,，加入 20μl 試劑三,，混勻后立即記錄 340nm 處初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

NADP-ME 活性計算：

（a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位,。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T = 3215×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位,。

NADP-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T =6.43×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑， 1cm,；V 樣：加入樣本體積,，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml,；T：反應(yīng)時間，1 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500 萬,。

b.用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T= 6431×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位,。

NADP-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T = 6431×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V 樣總×500) ÷T =12.86×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol/cm,；d：96 孔板光徑,， 0.5cm；V 樣：加入樣本體積,，0.01 ml,；V 樣總：加入提取液體積，1 ml,；T：反應(yīng)時間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500 萬,。

NADP-蘋果酸酶試劑盒 輔酶Ⅱ系列