NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中MDH 是TCA 循環(huán)的關鍵酶之一,，催化蘋果酸形成草酰乙酸,；相反，胞漿中 MDH 催化草酰乙酸形成蘋果酸,。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物,， 連接多條重要的代謝途徑。因此,，MDH 在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色,，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng),、活性氧代謝和抗病性等,。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH 和NADP-依賴的MDH,， NADP-MDH 主要存在于真核細胞中,。

測定原理：

NADP-MDH 催化NADPH 還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致 340nm 處光吸收下降,。

NADP-蘋果酸脫氫酶試劑盒 輔酶Ⅰ系列

組成：

試劑三,、粉劑×2 支,，-20℃保存；臨用前加入 300μl 蒸餾水,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融。

試劑四,、粉劑×2 支,，-20℃保存；臨用前加入 300μl 蒸餾水,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計,、臺式離心機,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、1 ml 石英比色皿和蒸餾水,。

樣本測定的準備：

1、細菌,、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 試劑一）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復 30 次）,；8000g 4℃離心 10min,，取上清置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 試劑一）,，進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測,。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、將試劑二在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上,。

3,、操作表：

將上述試劑按順序加入 1 ml 石英比色皿中，混勻后立即在 340 nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和反應 1min

后的吸光度A2,，計算ΔA=A1-A2,。

注意：若A1-A2 大于 0.5，需將樣本用提取液稀釋,，使 A1-A2 小于 0.5,，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù),。

NADP-MDH 活力單位的計算：

1,、血清（漿）NADP-MDH 活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=6430×ΔA 2,、組織,、細菌或細胞中 NADP-MDH 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADPH 定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADPH 定義為一個酶活力單位,。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADPH 定義為一個酶活力單位,。

NADP-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V 樣÷V 樣總×500）÷T=12.86×ΔA

V 反總：反應體系總體積，8×10^-4 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑,， 1cm,；V 樣：加入樣本體積，0.02 ml,；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml；T：反應時間,，1 min,；W：樣本質(zhì)量，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；500：細胞或細菌總數(shù),，500 萬,。

NADP-蘋果酸脫氫酶試劑盒 輔酶Ⅰ系列