NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,，線粒體中MDH 是TCA 循環(huán)的關鍵酶之一,，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反,，胞漿中 MDH 催化草酰乙酸形成蘋果酸,。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑,。因此,，MDH 在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝,、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng),、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性,，MDH分為NAD-依賴的MDH 和NADP-依賴的MDH,，細菌中通常只含有 NAD-MDH，在真核細胞中,，NAD-MDH分布于細胞質和線粒體中,。

測定原理：

NAD-MDH 催化NADH 還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致 340nm 處光吸收下降,。

NAD-蘋果酸脫氫酶試劑盒   輔酶Ⅰ系列

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀,、臺式離心機、水浴鍋,、可調式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板和蒸餾水。

樣本測定的準備：

1、細菌,、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內,，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（ml）為 1000~2000：1 的比例（建議 2000 萬細菌或細胞加入 1ml 試劑一）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 試劑一）,，進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測,。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,，調節(jié)波長至 340nm,，蒸餾水調零。

2,、檢測工作液的配制：用時在試劑三中加入 19ml 試劑二和 0.5ml 蒸餾水，充分混勻待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融。

3,、測定前將檢測工作液在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上,。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μl 樣本和 195μl 工作液,，混勻后立即記錄 340nm 處 20s 時的吸光值A1 和 1min20s 后的吸光值A2,，計算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2 大于 0.5,，需將樣本用提取液稀釋,，使 A1-A2 小于 0.5，可提高檢測靈敏度,。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù),。

NAD-MDH 活力單位的計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1,、血清（漿）NAD-MDH 活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=6430×ΔA 2,、組織,、細菌或細胞中 NAD-MDH 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

NAD-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V 樣÷V 樣總）÷T=3.215×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10^-4 L,；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,； V 樣：加入樣本體積，0.005 ml,；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml；T：反應時間,，1 min,；W：樣本質量， g,；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/ml；2000：細胞或細菌總數(shù),，2000 萬,。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）NAD-MDH 活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

NAD-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=12860×ΔA 2,、組織、細菌或細胞中 NAD-MDH 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織中每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位,。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T =12860×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V 樣÷V 樣總）÷T=6.43×ΔA

V 反總：反應體系總體積,，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm,； V 樣：加入樣本體積，0.005 ml,；V 樣總：加入提取液體積,，1 ml,；T：反應時間,，1 min,；W：樣本質量， g,；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/ml；2000：細胞或細菌總數(shù),，2000 萬,。

NAD-蘋果酸脫氫酶試劑盒   輔酶Ⅰ系列