輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,，NAD⁺是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要氫受體,，生成的NADH 經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成 ATP 的同時,，形成大量的ROS,，同時 NADH 再生為NAD⁺。糖,、脂,、蛋白質三大代謝物質分解中的氧化反應絕大部分通過這一體系完成,。NAD(H)含量和NADH/NAD⁺比值的高低可用于評價糖酵解和TCA 循環(huán)的強弱,。較高的 NAD(H)及NADH/NAD⁺比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài),。此外,，NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和TCA 循環(huán)。另外,，NAD⁺降解產(chǎn)物對細胞信號傳導,、代謝和基因表達等具有重要的調控作用。

測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD⁺和NADH,，NADH 通過PMS 的遞氫作用,，還原氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在 570nm 下檢測吸光值,；而 NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為 NADH,，進一步采用 MTT還原法檢測

輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒   輔酶Ⅰ系列

組成：

試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存,，用時加入 3ml 蒸餾水,，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周,；試劑四：粉劑×1 瓶,，4 ℃保存，用時加入 3ml 蒸餾水,，混勻,，用不完的試劑 4℃保存一周；

自備儀器和用品：

酶標儀,、臺式離心機,、移液器、96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

NAD+和 NADH 的提取：

1,、 血清（漿）中 NAD⁺和NADH 的提取

NAD⁺的提取：按照血清（漿）體積（ml）：酸性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1ml

血清（漿）,，加入 1ml 酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min,；取 500μl 上清液,，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

NADH 的提取：按照血清（漿）體積（ml）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1ml

血清（漿）,，加入 1ml 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min,；取 500μl 上清液,，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、組織中NAD⁺和NADH 的提取：

NAD⁺的提取：按照組織質量（g）：酸性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，加入 1ml 酸性提取液）,，冰浴研磨,，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）,；冰浴中冷卻后,，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液,，加入 500μl 堿性提取液使之中和,，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

NADH 的提取：按照組織質量（g）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，加入 1ml 堿性提取液）,，冰浴研磨,，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）,；冰浴中冷卻后,，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液,，加入 500μl 酸性提取液使之中和,，混勻，10000g 4 ℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

3,、 細胞或細菌中 NAD⁺和NADH 的提取：

NAD⁺的提取：先收集細胞或細菌到離心管內,，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：酸性提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 酸性提取液）,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復 30 次）,，95℃水浴 5min（蓋緊,，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后,，10000g 4 ℃離心 10min,；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和,，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

NADH 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內，棄上清,，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：堿性提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 堿性提取液）,，超聲波破碎（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復 30 次），95℃水浴 5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min,；取 500μl 上清液,，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min,，取上清，置冰上待測,。

測定步驟：

1,、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 570nm,，蒸餾水調零,。

2、加樣表(在 1.5ml 棕色EP 管中按下表依次加樣）：

充分混勻,，靜置 5min 后，20000g,，25℃離心 5min,，棄上清，沉淀中加入：混勻,，取 200μl 轉移至微量石英比色皿或 96 孔板中,，570nm 下讀取對照吸光值A1 和測定管吸光值 A2，計算△A=A2-A1,。

注意事項:

1,、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一,、二,、三和四按比例配成混合液。

2,、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一,、二、三,、四和五后必須馬上加試劑六,；測定管加完試劑一,、二、三,、四和五后必須反應 20min 后再加試劑六,。

3、反應過程中注意避光,。

4,、若NAD+測定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 測定中△A（A2-A1）≤0.0222,，說明樣本中輔酶含量較低,，已低于檢測限，可做如下調整：（1）將測定管避光靜置時間 20min 延長到 60min,；（2）在提取階段增加取樣量,，即取 0.2g 樣本或 0.2ml 樣本加入 1ml 提取液。

5,、由于每一個測定管需要設一個對照管,，本試劑盒 100 管保證測 48 個NAD⁺或NADH.

NAD+和 NADH 含量的計算:

（一） NAD⁺含量的計算

標準條件下的回歸曲線為y = 0.1475x + 0.0302，R² = 0.9978,；其中y 為△A,，x 為NAD⁺濃度nmol/ml 1、血清（漿）中 NAD⁺含量計算

NAD⁺含量(nmol/ml）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302）

2,、組織,、細菌或細胞中 NAD⁺含量計算 (1)按樣本蛋白濃度計算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302）÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

NAD⁺ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302）÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

NAD⁺ (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302）

（二）NADH 含量的計算

標準條件下的回歸曲線為y = 0.1404x + 0.0222，R² = 0.9976,；其中y 為△A,，x 為NADH 濃度nmol/ml 1、血清（漿）中 NADH 含量計算

NADH 含量(nmol/ml）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222）

2,、組織、細菌或細胞中 NADH 含量計算

(1) 按樣本蛋白濃度計算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222）÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222）÷W

(3) 按細菌或細胞密度計算

NADH (nmol/10⁴ cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222）

V1：加入反應體系中樣本體積,，0.02ml,；V2：加入提取液體積，2ml,；V3：加入血清（漿）體積：0.1ml,； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml,； W：樣本質量,，g；500：細胞或細菌總數(shù),，500 萬,。

注意：zui低檢測限為 0.1nmol/ml 或 0.1nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot

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