名稱：奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基試劑盒

貨號：WS001-100-KIT/WS001-500-KIT

規(guī)格：100ml/500ml

品牌：WinSera

一,、試劑盒組成：

二、使用方法：

1,、 原代
（1）取材后的奶牛乳腺組織須在 2-8℃含有組織保存液 E的取樣瓶中,，快速轉(zhuǎn)運至潔凈實驗室進行組織處理和干細胞分離，拍照并登記信息,。
（2）準備若干培養(yǎng)皿,，加入 4℃預(yù)冷的奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B備用。
（3）取樣瓶消毒,，將組織放入培養(yǎng)皿中,，利用奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B清洗三次后，利用眼科剪或手術(shù)dao將腫瘤組織jian切成體積約為1-3mm3的組織塊,。
（4）組織用奶牛乳腺原代組織xiao化液 C消化,，37℃震蕩消化10-20min，（消化過程中隨時觀察消化情況）,。
（5）取少量液體在顯微鏡下觀察,，鏡下觀察到較多的單個細胞或 70um 以下的細胞簇后，加入三倍體積奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B終止消化,。
（6）使用100um孔徑的篩網(wǎng)進行過濾,，將濾液收集后,，于300g富集離心5min后移去上清，添加奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B重新重懸離心,。
（7）基質(zhì)膠計算：第6步后觀察收集到的組織體積,，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠重懸鋪板。
（8）24孔細胞培養(yǎng)板為例,，每孔點膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進行鋪板（4℃下操作）,。
（9）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基 A（恢復(fù)室溫）進行培養(yǎng),。
2,、 類器官傳代培養(yǎng)
（1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液 B放置2min,。
（2）移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠,，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min,。（每6-8孔為一組）
（3）a. 類器官數(shù)量不足或體積較小時： 離心5min棄去上清,，添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步,。
b. 類器官數(shù)量較多或體積較大時：離心5min棄去上清,，添加適量類器官傳代消化液 D消化2-3min，添加奶牛乳腺類器官緩沖液 B終止消化,，離心5min棄去混合液,，添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步,。
（4）類器官收集后，添加基質(zhì)膠重懸,，每孔25ul基質(zhì)膠鋪在24孔細胞培養(yǎng)板中,，放置培養(yǎng)箱中10-15min添加500ul奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基 A。
3,、類器官凍存
（1）移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液 B放置2min。
（2）移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠,，收集在15ml離心管中,，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）離心5min棄去上清,，添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B再次重懸,，300g離心5min棄去液體。
（4）添加適量類器官凍存液 F,，輕柔吹打重懸,，以24孔細胞培養(yǎng)板為例：密度為2個孔凍存1管，每管體積1.4ml。
（5）做好標記信息,，進行程序降溫后,，移入液氮長期保存。
4,、 類器官復(fù)蘇
（1）取10ml奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B于15ml離心管中,。
（2）從液氮罐中取出凍存的類器官細胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解,。
（3）水浴融解過程中,，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2min內(nèi)全部融解,。
（4）將溶解后的類器官細胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 離心管,，使用移液管輕輕吹打6-8次，300g 離心 5min,，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀,。添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
（5）基質(zhì)膠重懸,，每孔25ul基質(zhì)膠鋪在24孔細胞培養(yǎng)板中,，放置培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500ul奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基 A,。

三,、儲存/保存方法

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溫馨提示：本產(chǎn)品僅作科研實驗使用,，不支持臨床等研究