人綠膿桿菌外毒素A（PEA）Elisa試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法（Sandwich ELISA）檢測樣品中靶蛋白的的濃度,，其原理見圖2,。靶蛋白特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標板上，當(dāng)加入標準品或樣品時,，其中的靶蛋白會與捕獲抗體結(jié)合,。當(dāng)加入生物素化的抗靶蛋白抗體后，生物素化抗靶蛋白抗體與靶蛋白結(jié)合,，形成夾心的免疫復(fù)合物

人綠膿桿菌外毒素A(PEA)Elisa試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

使用說明書

規(guī)格：48次,、96次

使用目的：血清、血漿及相關(guān)液體樣本

標本要求
標本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：

免疫吸附劑
已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月,。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被,。以下簡述固相載體和包被過程,。

固相載體
固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng),?？勺鱁LISA中載體的材料很多，zui常用的是聚苯乙烯,。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能,，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，加之它的價格低廉,，所以被普遍采用,。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式,。
ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板,、小珠和小試管。以微量滴定板zui為常用,，于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板,，上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測,，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后,，大小與標準ELISA板相同,。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測,，包括加樣、洗滌,、保溫,、比色等步驟，對操作的標準化極為有利,。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后,，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多,，但用于間接法測抗體時空白值較大,。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低,，孔底透明度高,，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能,。
與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯,。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質(zhì)軟板薄,，可剪割,、價廉,，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高,，但空白值也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣,，可應(yīng)用如下的試驗：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本,，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進行測定,，然后比較結(jié)果,。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別zui大這種載體就是這一ELISA測定項目的zui合適的固相載體。

人綠膿桿菌外毒素A(PEA)Elisa試劑盒陽性對照品和陰性對照品

陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控
制品,，同時也作為判斷結(jié)果的對照,，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標本的組成相*,。以人血清為標本的測定,，對照品zui也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底,。由于大量正常人血清較難得到,，國外試劑盒中的對照品多以復(fù)鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子,，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固,，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似,。陰性對照品須先行檢測,，確定其中不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg,，zui抗HBs也是陰性,。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì),，此量zui在試劑說明書中標明,。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可對標本中受檢物質(zhì)的量有一個粗略的估計,。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml,，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑,，以利保存,。

參考標準品
定量測定的ELISA試劑盒應(yīng)含有制作標準曲線用的參考標準品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-6個濃度,，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中,。

人綠膿桿菌外毒素A(PEA)Elisa試劑盒樣本前處理簡介

一）樣本前處理的目的、內(nèi)容,、重要性

1,、目的

樣本處理的zui終目的是將待測組分從樣本中分離出來，并達到能夠檢測的狀態(tài),。

2,、內(nèi)容

提取、凈化是主要的兩個內(nèi)容,，也有的需要進行濃縮甚至衍生化,。

3、重要性

      據(jù)統(tǒng)計,，人們常常將60%的時間花在樣品前處理上,。這不但不符合高效率的要求，而且煩瑣的傳統(tǒng)樣品處理方法也直接影響到zui后的分析結(jié)果,。

二）殘留分析的樣品種類

    組織（肌肉,、肝臟、魚,、蝦等）、蜂蜜,、蜂王漿,、花粉、飼料及其原料,、腸衣,、熟食、尿樣（豬尿,、牛尿,、羊尿等）、血清（牛血清,、豬血清,、雞血清等）、牛奶及奶粉、雞蛋,、糞便等,。

三）樣本前處理操作一般步驟

1、各種溶液配制

在實驗開始前按照說明書的要求配制出各種實驗需要的溶液,，實驗室已有的的溶液也應(yīng)考慮溶液的配制日期以及有效期

2,、樣本稱量/量取前的處理

有的樣本是冷凍保存，有的樣本在較低溫度時粘度較大在樣本且變得不均一,，它們稱量/量取前必須解凍或加熱,，夏天采用放置室內(nèi)解凍即可，冬天可以是防水的溫水浴解凍,，或24/37度溫箱解凍,，也可以采用暖氣片解凍，但是無論是什么樣的方式在解凍完成以后必須立即轉(zhuǎn)到室溫環(huán)境中來,，以免變質(zhì),，值得一提的是某些藥物的實驗樣本的解凍方式必須使用室溫解凍，其他的解凍方式均對結(jié)果都有很大的影響

3,、樣本稱量/量取

按照說明書規(guī)定的量進行稱量/量取,，對于外來復(fù)核的樣本稱量/量取應(yīng)更加的精確，當(dāng)稱量的量很少的情況下可由一般的天平轉(zhuǎn)到分析天平去稱量,，天平也要按時進行校正部分樣本采用量取的方式取樣,，在量取前必須保證量取容器的準確行；以保證樣本量準確

4,、樣本提取液加入

按照說明書給定的量和試劑/溶液的種類加入到樣本中,，量少的情況下可以用移液器進行轉(zhuǎn)移，當(dāng)需要的試劑/溶液量較大的情況下必須用移液管,。

注:需要做添加高濃度標準品的樣本,在加入提取液之前加入高濃度標準品

5,、震/振搖

該步驟有兩種方式，一種為長時間的使用震蕩器上震蕩,，該方法可定時定量,，但對于某些實驗不適用，另一種為較強烈的振蕩,，可用渦動儀強烈渦動,，也可以人為的上下振蕩。不同的實驗對時間的要求也不同,，要按照說明書進行

6,、離心

離心有三個影響因素，即為離心力,、時間,、溫度,，需要設(shè)定的參數(shù)就是三個參數(shù)，具體的設(shè)定方式因離心機不同而有一定的差異,，沒有條件的情況下要保證時間和離心機轉(zhuǎn)度,。

7、取液

１）取上層：這是zui為常見和zui簡單的取液方式,，僅僅需要按量取就可以

２）取中間層：zui不常見的取液方式,，一般情況下是去掉全部上層再吸取中間層，對于一些經(jīng)驗較為豐富的實驗員在處理部分實驗時可以直接突破上層取中間層

３）取下層：較4是像取中間那樣進行,，值得注意的是,，所有取液方式都有可能遇到取液時液體的量越取越體積越大，甚至吸到移液器內(nèi),，對于這樣的情況在取液時注意看液體的體積達到量就不繼續(xù)吸就可以了

7,、吹干

吹干的三個影響因素為氣體、溫度,、加熱方式

氣體：較為理想的吹干氣體為氮氣,，出于成本問題多數(shù)小規(guī)模實驗室一般采用空氣吹干，

溫度：根據(jù)藥物與提取溶劑的物理性質(zhì)選擇一個合適的溫度,，一般在50到60℃之間

加熱方式：一般有兩種方式,，分為水浴方式和干浴

8、復(fù)溶

吹干以后加入復(fù)溶液將藥物溶解出來的過程,，加速溶解的方式可為渦動溶解和超聲溶解,，時間時情況而定，一般僅使用渦動溶解

9,、樣本檢測

       該步驟的具體操作見試劑盒說明書中的檢測步驟,。

四）前處理相關(guān)試驗術(shù)語及定義

1、陰性和陽性

陰性：即樣本中不含被檢測物質(zhì),。

陽性：樣本中含有被檢測物質(zhì),。

2、假陰性與假陽性

假陰性：因某些因素的影響導(dǎo)致陽性樣本檢測結(jié)果為陰性的現(xiàn)象,。

假陽性：因某些因素的影響導(dǎo)致陰性樣本檢測結(jié)果為陽性的現(xiàn)象,。

3、靈敏度：試劑盒方法能檢測到待測藥物的zui底濃度,。

4、準確度：指測定值(平均值)與真值的接近程度,，表示分析結(jié)果的真實性,。通常用添加回收率來表示：

         回收率=(測定值-空白值)/添加量 ×100％

5、精密度：指用某種方法重復(fù)測定同一均質(zhì)樣品測定值彼此接近程度,，表示分析結(jié)果的重復(fù)性,，常用變異系數(shù)表示,。

6、檢測限（LOD  limit of detection）：檢測限指分析方法能夠從樣本的背景信號中檢測出待測物存在時所需的zui低濃度,。LOD反映了分析方法整體的靈敏度效能指標,。一般對分析方法在LOD水平的定量可信性（如精密度、回收率）不作要求,，一般要求殘留分析方法LOD≦0.1MRL    LOD=B+2SD或B+3SD

7,、定量限（LOQ  limit of quantitation）：指分析方法能夠?qū)悠分械拇郎y物進行定量測定的zui低濃度，用于定量方法的驗證,。

8,、殘留檢測限（ＭＲＬ）

規(guī)定允許食品中藥物zui高殘留量，很多情況下各國規(guī)定的ＭＲＬ值之間有一定的差異,，多數(shù)情況下我國規(guī)定的ＭＲＬ值較日本,、歐盟、美國的高一些,。

人綠膿桿菌外毒素A(PEA)Elisa試劑盒基本配套儀器

 1,、微孔板酶標儀450nm/630nm

2、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置

3,、均質(zhì)器

4,、振蕩器

5、渦旋儀

6,、離心機

7,、天平：感量0.01g

8、微量移液器：單道 20ml～200ml,、100ml～1000ml

多道 250ml

9,、超聲儀

10、恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱

11,、冰箱

12,、洗板機（可選）

13、磁力攪拌器

人綠膿桿菌外毒素A(PEA)Elisa試劑盒注意事項

1.實驗操作時需戴手套,、穿工作衣,，嚴格健全和執(zhí)行消毒隔離制度，各種實驗廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

2.終止液具有腐蝕性,，應(yīng)避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請立即用大量自來水沖洗,。

3.酶標板從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)恢復(fù)至室溫方可開袋,，未用完的酶標板需放入有干燥劑的密封袋中保存。

4.濃縮洗滌液在低溫時容易結(jié)晶,，使用時需恢復(fù)至室溫以*溶解,。

5.洗滌時各孔均需加滿液體,，防止孔口有游離酶不能洗凈。

6.用于檢測的樣品應(yīng)保持新鮮,。

7.試驗結(jié)果的判定必須以酶標儀讀數(shù)為準,。

8.不同批號試劑組分不得混用。

【儲存及有效期】 于2～8℃避光保存,，有效期為12個月