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貓杯狀病毒探針法熒光定量 RT-PCR 試劑盒說明書
閱讀：901 發(fā)布時(shí)間：2021-6-30貓杯狀病毒(Feline Calicivirus,，FCV)是一種 RNA 病毒,，會(huì)引起貓杯狀病毒感染，是一種貓病毒性呼吸道傳染病,，主要表現(xiàn)為上呼吸道癥狀,，即精神沉郁漿液性和粘液性鼻漏、結(jié)膜炎,、口腔炎,、氣管炎、支氣管炎,，伴有雙相熱,。貓杯狀病毒感染是貓的多發(fā)病，發(fā)病率高,，死亡率低,，因此貓杯狀病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)貓杯狀病毒的試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性高,。
3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品,。
4. 特異性高,，引物是根據(jù)貓杯狀病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒的 RNA
發(fā)生交叉反應(yīng),。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng),。
本產(chǎn)品只能用于科研。
成分 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 |
探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 190504a | 500μL（藍(lán)蓋） |
探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 190504b | 100μL（紅蓋） |
熒光PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） |
貓杯狀病毒探針法 qRT-PCR 引物混合液 | 15-79500yw | 100 μL（白蓋） |
貓杯狀病毒 qRT-PCR 探針 | 15-79500pb | 50 μL（棕色管） |
貓杯狀病毒探針法 qRT-PCR 陽性對(duì)照(1×10E8 拷貝/μL) | 60908-79500pc | 50 μL（黃蓋） |
使用手冊(cè) | 15-79500sc | 1 份 |
一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能
污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3，2,。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液,，最好用帶芯槍頭，下同）,。
在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供),，充分震
蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。
4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。
5. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。二、樣品 RNA 的制備
7. 如果有 N 個(gè)樣品,，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取,，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性
對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,?？梢杂?10μL 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC,。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容,。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout,。
三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板）,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板）,，1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：
- 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽性或陰性,，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35,，則為陽性,。