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技術(shù)文章

熒光及可視化 RT-LAMP 擴(kuò)增試劑盒簡(jiǎn)介

閱讀:1178          發(fā)布時(shí)間:2022-8-2

產(chǎn)品及特點(diǎn)

本產(chǎn)品是根據(jù)本公司的雙染料 RT-LAMP 技術(shù)開發(fā)的熒光和可見光雙模式檢 測(cè)試劑盒 ,,它既可以用于熒光 RT-LAMP 擴(kuò)增及檢測(cè) ,也可以用于可視化 RT-LAMP 擴(kuò)增及檢測(cè) ,,適用于各種針對(duì)核酸的快速定性檢測(cè),。  本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn):

1.   含可光和熒光染料,  既可以用金屬浴和水浴擴(kuò)增用可見光肉眼判斷結(jié)果 ,,也可

用熒光 PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè),。

2.   內(nèi)含的 dUTP-UNG 可防交叉污染

3.   特異性比 RT-PCR 高,,  因?yàn)?RT-LAMP 擴(kuò)增使用 4-6 條引物而不是兩條,。

4.   靈敏性可達(dá) 10 拷貝/反應(yīng)以下  (隨引物而不同)  ,故假陰性率更低,。

5.   只可用于科研 ,,只可進(jìn)行定性檢測(cè) ,不能用于定量檢測(cè),。

規(guī)格及成分

 

   

編號(hào)

塑料盒包裝

 

MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(含 RI),,  200UL

60905a

50 μL  (黃蓋)

4 ×RT Buffer  (含 dNTP)

60905b

250 μL  (白蓋)

5 ×熒光及可視化 LAMP MagicMix

200603a

200 μL  (綠蓋)

Bst DNA 聚合酶 2.0  ( 8U/uL)

200403

50 uL (紅蓋)

RT-LAMP 陽(yáng)性對(duì)照模板-引物混合物

130923a

20 μL  (黃蓋)

純水

100935

1mL  (亮黃蓋)

使用手冊(cè)

200603sc

1 

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸,  -20 ℃保存,,保存期限為一年,。

備試劑

RT-LAMP 模板及 RT-LAMP 引物、PCR 級(jí)石蠟油  (僅對(duì)使用金屬浴或水浴者)  ,。

使用方

準(zhǔn)備工作:如果使用水浴鍋或金屬浴,,  需要在實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)前打開并調(diào)到 60-65℃。如果 用金屬浴,,還必須在孔中加水以填充金屬孔和反應(yīng)管間的空隙,。金屬浴和水浴溫控遠(yuǎn) 遠(yuǎn)不如 PCR 儀器,  所以使用前需要用陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照  (水)  做預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)可用,。

,、  樣品 RNA 的制備

1.  用自選方法純化樣品的 RNA,,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) RNA 提取試劑盒兼容。

2.  如果有 N 個(gè)樣品,,  則至少需要做 N+2 個(gè)樣品制備,,  包括一個(gè)制備陽(yáng)性對(duì)照(制備

時(shí)加入自備的跟要測(cè)的靶分子相同的陽(yáng)性對(duì)照模板, 一起經(jīng)歷提取過程) 和一個(gè) 陰性對(duì)照  (用水替代樣品),。最后 N+2 個(gè)樣品一起進(jìn)行 RNA 提取操作,得

N+2 個(gè) RNA 樣品,。

二,、  合成 1st-strand cDNA

3.  按下表配制 RT 反應(yīng)體系:

 

加入

 

 


   

RNA 模板

 RNA

poly(A) mRNA

或?qū)R坏?/span> RNA

注意 RNA 樣品不能有基因組 DNA 污染。

 

 

100-500 ng

10-500 ng

0.01pg-500ng

 

自備引物 F3

1 μL

4 ×RT Buffer  (含 dNTP)

5 μL

RNase-free 

補(bǔ)水到  19 μL

4.  70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴,。

5.  37℃保 5 分鐘,。對(duì)富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的高 GC RNA 模板,可改成 45℃保溫 5 分鐘,。

6.  加入 1 μL (=200 U) MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(含 RI)  ,,終體積為 20μL

7.  42℃保溫 60 分鐘,。

8.  70℃保溫  10 分鐘以終止反應(yīng),,放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為

LAMP 模板使用,,不需要純化,。

三、   熒光及可視化 LAMP 擴(kuò)增及檢測(cè)  ( 20μL 體系)

9.  應(yīng)設(shè)置:如果有 N+2 個(gè) cDNA 樣品,,則最好設(shè)置 N+4 個(gè) LAMP 擴(kuò)增,,增加 LAMP

陰性對(duì)照和 LAMP 陽(yáng)性對(duì)照各 1 個(gè)。在 N+4 個(gè) 0.2mL PCR 管中加入下列成分:

 

N+2 個(gè)

樣品管

LAMP  性對(duì)照

LAMP

陽(yáng)性對(duì)照

5 × 熒 光 及 可 視 化 LAMP MagicMix

4 μL

4 μL

4 μL

20×引物混合液

 1 μL

1 μL

-

N+2 個(gè)樣品cDNA

最多 14 μL

-

-

RT-LAMP 陽(yáng)性對(duì)照 模板-引物混合物

 

-

 

-

15 μL

Bst DNA 合酶 2.0

 1 μL

1 μL

 1 μL

純水

 

14 μL

-

 

10. 混勻后進(jìn)行擴(kuò)增,。由于本產(chǎn)品含雙染料, 可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇下列三種方式進(jìn) 擴(kuò)增和檢測(cè),。

11. 如果使用 PCR 儀,、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增,肉眼檢測(cè),,則必須先在每個(gè)反應(yīng)管中  30 μL 自備的石蠟油,,否則保溫期間反應(yīng)體系的水分會(huì)蒸發(fā),影響反應(yīng)效率(如 果使用 PCR 儀器并開啟熱蓋,,則可以不加石蠟油),。  60-65℃保 90 分鐘,,肉 眼觀察管內(nèi)液體顏色,。

12. 如果使用熒光定量 PCR 儀:  設(shè)為 60-65℃保溫 1 分鐘/循環(huán),,   90 個(gè)循環(huán),  每分

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

鐘在 FAM 通道采集一次熒光信號(hào),。

13. 如使用 PCR 儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增,,再使用 qPCR 儀進(jìn)行終點(diǎn)法熒光讀數(shù): 則在擴(kuò)增前和擴(kuò)增后,,分別在 qPCR 儀器上測(cè)熒光讀數(shù)(溫度設(shè)為 60-65 ℃,  1 循環(huán),,每次循環(huán) 1 分鐘,,在 FAM 通道采集一次熒光信號(hào)。注意:  測(cè)熒光讀數(shù)必 須在 65℃進(jìn)行)  ,。擴(kuò)增反應(yīng)按 60-65 ℃ ,90 分鐘進(jìn)行,。

,、   結(jié)果分析及解讀

14. 如果是用普通 PCR 儀器、水浴或金屬浴進(jìn)行的擴(kuò)增,,反應(yīng)結(jié)束后只能肉眼判斷結(jié) 果,。將反應(yīng)管放置白色背景(如白紙) 前觀察。擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)液將呈現(xiàn) 藍(lán)色,,無模板和無引物的陰性對(duì)照將呈淺藍(lán)色,。如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)液不呈 現(xiàn)藍(lán),或無模板和無引物的陰性對(duì)照任何一個(gè)呈現(xiàn)藍(lán)色,,則說明試劑有問題,, 實(shí) 驗(yàn)無效。請(qǐng)跟廠家聯(lián)系,。

15. 如果實(shí)驗(yàn)有效,,  則分析 N+2 個(gè)樣品管的結(jié)果。如果樣品管反應(yīng)液的顏色接近擴(kuò)增 陽(yáng)性對(duì)管則說明有擴(kuò)增,,如果接近無模板和無引物的陰性對(duì)照,,  則說明無擴(kuò)增。 反應(yīng)結(jié)果示例見左圖(9 為陰性,,  10 為陽(yáng)性)  ,。

16. 如果用熒光 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增, 則可分析擴(kuò)增曲線和 Ct,。試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照  Ct 將小于 60,,如果大于 60,,說明試劑可能失效,  需跟廠家聯(lián)系,。無模板陰性 對(duì)照和無引物陰性對(duì)照的 Ct 將大于 90,。如果任何小于 90,則說明試劑或環(huán)境被 污染,,需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或跟廠家聯(lián)系,。如果陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照 Ct 都在正常范圍,則 分析樣品的 Ct,。Ct 小于 60 的判斷為陽(yáng)性,,大于 90 判為陰性,  在 60-90 之間則 需要重復(fù)檢測(cè),。

17. 如果使用 PCR 儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增,,肉眼檢測(cè),,再使用熒光定量 PCR  進(jìn)終點(diǎn)法熒光讀數(shù)來判斷陰陽(yáng)性, 則先比較陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,。陽(yáng)性對(duì)照樣品 擴(kuò)增后信號(hào)增幅應(yīng)該超過 100%,,  陰性對(duì)照擴(kuò)增后信號(hào)增幅應(yīng)該低于 50%,否則 實(shí)驗(yàn)無效,, 請(qǐng)與廠家聯(lián)系,。如果兩個(gè)對(duì)照均有效,則比較樣品擴(kuò)增前后熒光讀數(shù)的 差值,。如果擴(kuò)增后熒光信號(hào)增幅低于 50%,,則判斷為陰性。如果熒光信號(hào)增幅高 100%,,則判斷為陽(yáng)性,。熒光信號(hào)增幅在 50- 100%之間的,  則需要重測(cè),。

18. 當(dāng)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)和可視化檢測(cè)同時(shí)用于判讀結(jié)果時(shí),,如果彼此不一致, 以實(shí)時(shí)熒光 LAMP 的數(shù)據(jù)為準(zhǔn),。一般可視化結(jié)果滯后實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果 20-30 分鐘,,也就是 說,在 qPCR 儀上第 30 分鐘時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性的樣品,,  其反應(yīng)液的顏色變化一般在第

50-60 分鐘時(shí)才能觀察到,。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

酸純化病毒保存液,  PCR 級(jí)石蠟油

 

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