人黑色素瘤標(biāo)記物（MART）Elisa試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法（Sandwich ELISA）檢測樣品中靶蛋白的的濃度，其原理見圖2,。靶蛋白特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時,，其中的靶蛋白會與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入生物素化的抗靶蛋白抗體后,，生物素化抗靶蛋白抗體與靶蛋白結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物

人黑色素瘤標(biāo)記物(MART)Elisa試劑盒是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程,。抗原或抗體包被時所用的濃度較低,，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附,。封閉的手續(xù)與包被相類似,。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑,，其zui大的特點(diǎn)是價廉，可以高濃度使用（5%）,。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜,，而且封閉后的載體不易長期保存,，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。 
封閉是否必要,，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固相均需封閉,，封閉不當(dāng)反而會使陰性本底增高。一般說來,，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的,，操作時洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果,。特別是用單抗腹水直接包被時,，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面,，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用,。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的,。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月,。

4.2 結(jié)合物
人黑色素瘤標(biāo)記物(MART)Elisa試劑盒結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中zui關(guān)鍵的試劑,。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性,。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外,，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性,。

4.2.1 酶
用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高,，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng),，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富,，價格便宜，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力,。zui在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶,。另外,，它的相應(yīng)底物易于制備和保存,，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等
在ELISA中,，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中,，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等,。
國產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白,，含糖量約為18%,，分子量為44000,，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成,，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有zui高吸收峰,，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),，在403nm波長處有zui高吸收峰,。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文,，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比,，高純度的HRP的RZ≥?.0。
HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外,，更有價格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點(diǎn)。值得注意的是,，在選用酶制劑時,，除其純度RZ外,，更應(yīng)注意酶的活力,。高純度的酶如保存不當(dāng)，活力也會降低,。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進(jìn)行試驗(yàn),。
國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶。常用的AP有兩個來源,，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特略不相同,，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000,，酶作用的pH為8.0,；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000,，zui適pH為9.6。在ELISA中,，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低,，但AP價格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較HRP低,。

4.2.2 抗原和抗體
人黑色素瘤標(biāo)記物(MART)Elisa試劑盒制備結(jié)合物時所用抗體一般均為純度較高的IgG,，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾,。zui用親和層析純的抗體,，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng),，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。如用F(ab')2進(jìn)行標(biāo)記,，則更可避免標(biāo)本中RF的干擾。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多,，總的要求是抗原必須是高純度的,。

4.2.3 結(jié)合物的制備
酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種,，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法,。
（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié),。堿性磷酸酶一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法分一步法,、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中,，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體,。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便,、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的,，酶與抗體交聯(lián)時分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小也不均一,，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián),，影響效果,。在兩步法中,，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后,，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與戊二醛作用,，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的,，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低,。
（2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法,。反應(yīng)時,，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑,，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合,。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其*比例為：酶/抗體=1~2/1。此法簡便有效,，一般認(rèn)為是HRPzui可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所用試劑較為強(qiáng)烈,，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演,。 
按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體,。理論上,，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測定,，因經(jīng)過*洗滌，游離酶可被除去,，并不影響zui終的顯色。但游離的抗體則不同,，它會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量,。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化,，去除游離的酶和抗體后用于檢測,，效果更好。純化的方法很多,，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法zui為簡便,，但效果并不理想，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶,，但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取,，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得*的分離效果，但費(fèi)用較貴,。
結(jié)合物制得后，在用作人黑色素瘤標(biāo)記物(MART)Elisa試劑盒前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?。使用過濃的結(jié)合物,，既不經(jīng)濟(jì),，又可使本底增高,；結(jié)合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性,。所以必須對結(jié)合物的濃度予以選擇。zui適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時,，能維護(hù)一個低的本底，并獲得測定的*靈敏度,，達(dá)到zui合適的測定條件和測定費(fèi)用的節(jié)省,。就酶標(biāo)抗體本身而言,，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時，能得到陽性反應(yīng)的zui高稀釋度,。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后,，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗(yàn)時，將發(fā)生陽性反應(yīng),。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標(biāo)抗體的zui適工作濃度受到固相載體的性質(zhì),、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時間等的影響,，因此必須在實(shí)際測定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的zui大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度,。