DNA快速連接試劑盒產(chǎn)品及特點DNA 連接反應(yīng)通過 T4 連接酶催化雙鏈 DNA 的 3'-OH 和 5'-P 形成磷酸二脂鍵而將DNA共價連接在一起。被連接的DNA末端可以是粘末端（例如限制性切割 EcoR I 產(chǎn)生的末端）,，也可以是平末端（限制性切割 Sma I產(chǎn)生的末端）

DNA快速連接試劑盒產(chǎn)品及特點
DNA 連接反應(yīng)通過 T4 連接酶催化雙鏈 DNA 的 3'-OH 和 5'-P 形成磷酸二脂鍵而將DNA共價連接在一起,。被連接的DNA末端可以是粘末端（例如限制性切割 EcoR I 產(chǎn)生的末端），也可以是平末端（限制性切割 Sma I產(chǎn)生的末端）,。Pheiffer 等人發(fā)現(xiàn) PEG 可以促進(jìn) T4 DNA 連接酶催化的
連接反應(yīng)[NAR, 11, 7853-7871, 1983],，連接反應(yīng)只需十分鐘即可完成。
本產(chǎn)品就是根據(jù)這一原理設(shè)計,，

DNA快速連接試劑盒特點如下：
1. 超快,，整個連接反應(yīng)只需要室溫 5 分鐘左右，反應(yīng)液可以直接用于轉(zhuǎn)
化實驗,。
2. 高效,，溶液配方經(jīng)過優(yōu)化，每 ug 插入 DNA 連接轉(zhuǎn)化得到的重組子可
達(dá) 107左右,。
3. 既可用于平末端連接,，也可用于粘末端連接,，包括 PCR 產(chǎn)物與 T 載
體的連接。
4. 簡單,，客戶只需要提供載體和插入片段即可,。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 30 次塑料袋包裝 100 次塑料袋包裝
溶液 A 70602A 150 uL 500 uL
溶液 B 70602B 30 uL 100 uL
使用手冊 70602sc 1 份 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存,，有效期一年,。
使用方法 一: 連接反應(yīng)
1. 在無菌的離心管中嚴(yán)格按下表順序加入列各成分（以 10 uL 體系為
例）:
成分 陰性對照管 樣品管
溶液 A 5 uL 5 uL
插入片段（自備） - 0.2-0.5 ug(注)
載體（自備） 50 ng 50 ng
無菌水 補水到 9 uL 補水到 9 uL
注: 插入 DNA 片段的摩爾數(shù)zui是載體的 3-10 倍，如果載體長度
為 3000bp,，則所需插入 DNA 片段折合成重量(ng) ＝ (插入 DNA
片段 bp 數(shù)×50 ng×N)÷3000 bp,。N 就是自己選定的插入 DNA
片段與載體的摩爾比。
2. zui后在每管中加入 1 uL 溶液 B,，輕柔吹打混合均勻后用微量離心機(jī)
將液體全部甩到管底。
3. 室溫放置至少 5 分鐘,，zui長可以放置過夜,。
4. 70℃保溫 10 分鐘。此步可以滅活有關(guān)的酶,，否則轉(zhuǎn)化效率有所降低,。
5. 根據(jù)使用的轉(zhuǎn)化方法，每管各取適量用于轉(zhuǎn)化實驗,，余下的放置在
-20℃保存,。
二：細(xì)菌轉(zhuǎn)化及篩選（僅供參考，本產(chǎn)品不提供相關(guān)試劑）
6. 將 100 μL 轉(zhuǎn)化效率在 1×108 cfu/µg 以上的感受態(tài)細(xì)胞于冰上解
凍,。
7. 取 5-10 μL 連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中,，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻。
8. 在冰上放置 30 分鐘,。
9. 將離心管放 42℃熱休克 90 秒,，然后快速將其轉(zhuǎn)移到冰浴中放置 1~2
分鐘。
10. 每管中加 900 μL LB 培養(yǎng)基,，37℃振蕩培養(yǎng) 1 小時復(fù)蘇細(xì)胞,。
11. 將 100 uL 復(fù)蘇涂布到含 Amp 的 LB 瓊脂平板上（根據(jù)載體情況也
可能需要加上 X-gal 和 IPTG）。
12. 室溫 4,000 rpm 離心剩余的 900 uL 復(fù)蘇細(xì)胞 5 分鐘,，棄去 800 μ
L 上清,，用剩余 100 μL 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并涂布到含 Amp 的 LB 瓊脂
平板上（可加 X-gal、IPTG）,。
13. 將平板置于室溫直至液體被吸收,。此步非常重要，否則培養(yǎng)板將在
37℃排除水分,，細(xì)菌將隨水在培養(yǎng)基上到處游動,，不能形成單個菌落,。
14. 倒置平皿，于 37℃培養(yǎng),，12~16 小時后可出現(xiàn)菌落,。一般情況下陽
性對照組會有上千個菌落（100 uL 轉(zhuǎn)化液產(chǎn)生的菌落數(shù)×10），自聯(lián)
對照只有少數(shù)幾個菌落,，樣品組的菌落數(shù)取決于 PCR 回收片段的質(zhì)
量,。
15. 按常規(guī)方法篩選重組子。
技術(shù)資料
DNA 連接酶催化 DNA 連接的分子機(jī)制