DNA5’末端標記試劑盒產品及特點 本產品為 DNA 5’末端標記系統(tǒng),，利用 T4 Polynucleotide Kinase（T4多聚核苷酸激酶）和［γ-32P］ATP 對粘性末端或平末端的 DNA 或 RNA 的 5’
末端進行高效標記反應。原理如下：

DNA5’末端標記試劑盒具有下列特點：
1. 使用本試劑盒之前,，不需要對 5’末端的磷酸基團進行去磷酸化處理,，因
為使用的 kinase 能使 5’末端的磷酸與[γ-32P]ATP 的γ-磷酸進行交換。
2. 合成的單鏈或雙寡核苷酸的 5’末端游離的 OH 基團都能通過 Kinase 反
應被標記（或者只是簡單的磷酸化）,。
3. 提供的兩種反應液使交換反應和磷酸化反應都能高效進行,，均能得到大于
106 cpm/pmol（5’-end）的比活性。
規(guī)格及成分 成份 編號 熱封袋包裝
T4 多聚核苷酸激酶（10 U/μL） 131036A 20 μL
5×交換反應緩沖液 131036B 100 μL
10×磷酸緩沖液 131036C 50 μL
Control DNA 131036D 20 μL
使用手冊 1 份
運輸及保存 低溫運輸,，-20℃保存,，有效期一年。
自備試劑 DNA 段,、［γ-32P］ATP 或其它的標記,、未標記的 ATPs、牛小腸堿性磷酸
酶（CIAP）等
使用方法 一,、交換反應
1. 實驗前需自備的試劑：7 M 醋酸銨、100%乙,、70%乙等
2. 在微量離心管中制備下列反應液：
成分 加入的體積
自備的 5’磷酸化 DNA 段 14 μL(≤5 pmoles 的 5′末端)
5×交換反應緩沖液 5 μL
[γ -32P] ATP 5 μL
T4 多聚核苷酸激酶（10 U/μL） 1 μL
滅菌的超純水 補足到 25 μL
注：5 pmoles 的 5’末端約等于 0.17 μg 的長 100 bp 的雙鏈 DNA,。
3. 37℃反應 30 分鐘。
4. 70℃加熱 5～10 分鐘使酶失活,。
5. 加入 10 μL 的 7 M CH3COONH4（pH 4.5）,。如使用 CH3COONa 做
乙沉淀時使其終濃度達 300 mM。
6. 加入 87.5 μL（2.5 倍）的冷無水乙,，-20℃放置 30～60 分鐘,。
7. 離心回收沉淀，用 70%的冷乙清洗沉淀,，真空干燥,。
8. 用適當 Buffer 溶解沉淀。
注：通過第 5～8 步操作幾乎可以除去大部分未反應的[γ-32P] ATP,，如要
*將其除去時,，乙沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用苯酚抽
提除去蛋白質時,，請在第 8 步之后進行,。
二、磷酸化反應標記
A. 去磷酸化反應
1. 實驗前需自備的試劑：TE 飽和酚/,、3 M NaCl ,、100%乙,、70%
乙醇、牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）等
2. 在微量離心管中制備下列反應液：
成分 加入的體積
自備的 DNA 段 133 μL(≤10 μg)
1 M Tris-HCl,，pH 8.0 15 μL
牛小腸堿性磷酸酶
（CIAP,，10~20 U/μL）
2 μL
滅菌的超純水 補足到 150 μL
3. 50℃反應 30 分鐘。
4. 加入 150 μL 的 TE 飽和酚/異戊醇（25：24：1）,，充分混勻,。
5. 離心，取上層（水層）移到另一個微量離心管中,。
6. 重復操作 4～5,。
7. 加入 7.5 μL 的 3 M NaCl（zui終濃度 150 mM）。
8. 加入 375 μL（2.5 倍量）的冷無水乙醇,，-20℃放置 30～60 分鐘,。
9. 離心回收沉淀，用 1 mL 70%的冷乙醇清洗后,，沉淀真空干燥,。
10. 使用 20 μL 的 TE Buffer 溶解沉淀。
B. 磷酸化反應（前反應）
1. 在微量離心管中制備下列反應液：
成分 加入的體積
自備的 DNA 段 20.5 μL(≤5 pmoles 的 5′末端)
10×磷酸緩沖液 2.5 μL
[γ -32P] ATP 1 μL
T4 多聚核苷酸激酶（10 U/μL） 1 μL
滅菌的超純水 補足到 25 μL
2. 37℃反應 30 分鐘,。
3. 下面的操作與交換反應的第 4-8 步操作相同,。
三、合成 DNA 寡核苷酸的標記
1. 在微量離心管中制備下列反應液：
成分 加入的體積
Oligonucleotide DNA with free
5’-OH(5～10 pmoles)
≤3 μL
10×磷酸緩沖液 2.5 μL
[γ -32P] ATP 1 μL
T4 多聚核苷酸激酶（10 U/μL） 1 μL
滅菌的超純水 補足到 25 μL
2. 37℃反應 30 分鐘,。
3. 下面的操作與交換反應的第 4-8 步操作相同,。
四、合成 DNA 寡核苷酸的標記
當摻入水平很低的時候,，需要使用本步驟,，即通過體積排阻色譜或過濾試
劑盒除去未反應的標記。Sephadex G-50 層析柱（需另購）對于去除未摻入
的 dNTPs 效果很好,，它還能大幅減少小于 20 個堿基的 DNA 寡核苷酸和小于
20 bp 的雙鏈 DNA 的量,。使用之前需要在 70℃加熱 5～10 分鐘以使 T4 多
聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 層析柱可以用來純化長度不小于 10 個
堿基的寡核苷酸,。
使用舉例 按照使用方法中交換反應和合成 DNA 寡核苷酸的標記的實驗操作,，取λ
-BstP I，λ-Hpa I,，λ-EcoT22 I 各 3 pmols,，用［γ-32 P］ATP 通過正向
磷酸化反應或交換反應標記。各 DNA 段的放射自顯影結果如下所示：

DNA5’末端標記試劑盒注意事項 1. 緩沖液可在室溫融解,。融解后立即置于冰中,，使用前充分混勻。
2. 5×交換反應緩沖液于-20℃凍結保存時會有白色渾濁出現，但不影響反
應效果,。
3. 酶切得到的 DNA 段需經乙醇沉淀等方法純化,。
4. 當用于交換反應的 DNA 在 5 pmoles 以上（約 1,000 bp 以上）時，
標記效率有時會低于 106 cpm/pmol,。
5. 如果交換反應所用 DNA 低于 500 bp 時,，標記效率有時會有所降低。
6. 若不進行放射線標記,，僅使用本試劑盒做 5′末端磷酸化反應時,，反應體
系中的［γ-32P］ATP 可用 5 μL 的 10 mM ATP 代替。
7. 磷酸化反應時的［γ-32P］ATP 可用［γ-35S］ATP 替代,。
DNA5’末端標記試劑盒關聯(lián)產品 超快蛋白銀染試劑盒（CAT#:100810）,、質譜兼容型蛋白銀染試劑盒
（CAT#:100811）