DNA Shuffling試劑盒產(chǎn)品及特點 DNA Shuffling 即 DNA 分子的體外同源重組,，它是一種分子水平上的定向進化（directed evolution）技術(shù),，它以一個或多個基因為起始材料，通過先隨機斷裂成小片段,，再進行互為模板和引物的 PCR（無外加引物）,，Z后再進行常規(guī)PCR（外加引物）等處理，Z后得到含有大量 DNA 重組突變的 PCR 產(chǎn)物,。

DNA Shuffling試劑盒產(chǎn)品及特點 DNA Shuffling 即 DNA 分子的體外同源重組,，它是一種分子水平上的定向進化(directed evolution)技術(shù)，它以一個或多個基因為起始材料,，通過先隨機
斷裂成小片段,，再進行互為模板和引物的 PCR（無外加引物），zui后再進行常規(guī)
PCR（外加引物）等處理,，zui后得到含有大量 DNA 重組突變的 PCR 產(chǎn)物,。

DNA Shuffling試劑盒其原理示意圖如下：

就是根據(jù)上述原理優(yōu)化改進而成，它具有下列特點：
1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,，無需單獨準備各成分。
2. 操作手冊經(jīng)過優(yōu)化,，1-2 天即可完成,，節(jié)省大量優(yōu)化時間。
3. 本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷,。 規(guī)格及成分 成分 編號 十孔盒包裝
PCR Mix 3.0（含染料） 90805A 1 mL×3
DNase I 溶液（1U/μL） 90903A 10 μL
溶液 A，10× 131178A 100 μL
溶液 B,，10× 131178B 100 μL
超純水 100935 1 mL
使用手冊 131178sc 1 份
運輸及保存 低溫運輸,，-20℃保存,，保存期限一年。 自備試劑 待突變基因片段,、DNA Shuffling 引物（第二輪 PCR 引物）,、膠回收試劑盒。
使用方法 1. 待突變基因片段的制備：待突變基因片段可以用含一個或多個同源基因的質(zhì)
粒為模板,、用 PCR 法或酶切法制備,。制備時需保證含同源基因（或此同源
基因的一部分）的 DNA 段總長度不要超過 1kb，同時比 DNA shuffling
終產(chǎn)物（第二輪 PCR 產(chǎn)物）長 200-400 bp,。每次 DNA Shuffling 實驗至
少需要 2 μg 起始 DNA 段（如果含幾個同源基因片段,，則彼此的比例為
1:1:1），zui多可以達 5 μg 起始 DNA 段,，并且必須通過膠回收的方法回
收,，以便*去除殘留的質(zhì)粒模板、引物和非特異擴增產(chǎn)物等,。zui后需用分
光光度法準確定量,。如果不去除此步的引物，其將對后續(xù) PCR 造成嚴重干
擾,。
2. 提前準備 37℃和 75℃水浴,，同時新鮮配制 0.1U/μL 的 DNase 工作液放
冰上待用（必須在用時才配制，方法是將 1 μL 本試劑盒提供的 1U/uL 的
DNase I 溶液和 1 μL 溶液 A 和 8 μL 超純水混合）,。此溶液需在 24 小時
內(nèi)使用,。
3. 在一個離心管中，按順序加入下列成分：
成分 用量
待突變同源基因片段（第 1 步制備所得） 2-5 μg
溶液 A 5 μL
溶液 B 5 μL
DNase I 工作液（第 2 步制備所得） 2 μL
補超純水到 50 μL
4. 充分輕柔吹打混勻后 37℃水浴 8 分鐘,，然后立即放 75℃水浴處理 10 分鐘
以滅活 DNase I,。
5. 在 2-3%瓊脂糖凝膠上電泳，用常規(guī)的膠回收法回收 25-150 bp 范圍的所
有片段待用,。注意：一定要加合適的 DNA marker 以便確定片段范圍,。
6. 分光光度法精確測定回收片段的濃度。
7. 在 PCR 管中按順序加入 0.5 μg 上步回收得到的回收片段,、50 μL PCR Mix
3.0,、加超純水到 100 μL。
8. 按下面的 PCR 反應參數(shù)進行*輪無引物 PCR：
過程 溫度 時間
PCR 前變性 94℃ 150 s
PCR 反應 94℃ 30 s
（40 循環(huán)） 47.5℃ 45 s
72℃ 10 s,，每次循環(huán)后增加 5s
PCR 后延伸 72℃ 10 min
9. 取 5-10 μL 進行電泳檢測（本 PCR mix 含上樣成分,，可以直接上樣。紅色
染料的泳動速度相當于 50bp DNA）,，然后進行 PCR 回收,，去除小片段 DNA
的干擾，得到*輪 PCR 產(chǎn)物,。
10. 將回收的*輪 PCR 產(chǎn)物原液,、10 倍,、20 倍和 50 倍稀釋液各 1uL 作為
PCR 模板設置 4 管第二輪 PCR 反應。
成分 用量
PCR 模板 1 μL
PCR Mix 3.0 50 μL
自備 DNA Shuffling 引物 各 30 pmol
超純水 加水到 100 μL
11. 按下列 PCR 參數(shù)進行第二輪 PCR,。
過程 溫度 時間
活化 94℃ 150 s
PCR 反應
（25 次循環(huán)）
94℃ 30 s
47.5℃ 45 s
72℃ 60 s,，每次循環(huán)后增加 5s
PCR 后延伸 72℃ 10 min
12. 電泳檢測 4 個 PCR 產(chǎn)物，回收預期大小的 PCR 產(chǎn)物,，用于后續(xù)實驗（略）,。 答客問 Q：易錯 PCR 和 DNA Shuffling 有何區(qū)別？

A：前者引入的是點突變,，后者引入的是重組突變。示意圖如下：
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 即用型易錯 PCR 試劑盒（CAT#:101005-100）