cDNA第二鏈合成試劑盒（1103-1）產(chǎn)品及特點(diǎn) 本試劑盒提供合成 cDNA *鏈所需要的全部試劑。其原理是用突變的莫洛尼氏鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（M-MuLV RT）高效合成 mRNA 的全長 cDNA 拷貝,。
1. 使用突變的反轉(zhuǎn)錄酶,，內(nèi)源 RNase H 活性低。
2. zui長可合成 13 Kb 的 cDNA,。
3. 可以使用 oligo-dT,、隨機(jī)引物和 RNA 專一性引物三種引物（前兩種本試劑盒提
供）。
4. 總 RNA,、poly(A)+RNA 或特殊 RNA 均可作為模板,。
5. 可用于 cDNA 文庫構(gòu)建、RT-PCR,、探針標(biāo)記等,。 規(guī)格及成分 成 份 編號 十塊盒包裝
MMLV（含 RI） 60906A 100 uL
RT Buffer（含 dNTP） 60906B 250 uL
Oligo (dT)18 引物(0.5 ug/uL) 100814 50 uL
隨機(jī)引物(0.2 ug/uL) 100409 50 uL
RNase-free 水 80403 1 mL
使用手冊 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年,。 使用方法 一：合成 PCR 用的 1st-strand cDNA
1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系:
RNA 模板
總 RNA 100-500 ng
或 poly(A) mRNA 10-500 ng
或?qū)Ｒ坏?RNA 0.01 pg-500 ng
注意：RNA 樣品不能含有基因組 DNA 污染,。
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或隨機(jī)引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或 RNA 模板專一性引物 15-20 pmol
cDNA第二鏈合成試劑盒（1103-1）注意：隨機(jī)引物與 RNA 模板的比例跟 cDNA 合
成的平均長度成反比。
RNase-free 水 補(bǔ)水到 13 uL
2. 70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴,。
3. 再加入 5 uL RT Buffer（含 dNTP）,。
4. 37℃保溫 5 分鐘。對富含二級結(jié)構(gòu)的高 GC RNA 模板,，可以改成 45℃保
溫 5 分鐘,。如果使用隨機(jī)引物，則改成 25℃ 5 分鐘,。
5. 加入 2 uL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI）,，反應(yīng)終體積為 20 uL。
6. 42℃保溫 60 分鐘（但如果使用隨機(jī)引物,，需要先 25℃保溫 10 分鐘,，然
后再轉(zhuǎn)移到 42℃保溫 60 分鐘）。此步為 RT 反應(yīng),。
7. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng),，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以
直接作為 PCR 模板使用,，不需要純化,。
二：合成建文庫用的 1st-strand cDNA
1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系:
RNA 模板
poly(A) mRNA 1 ug
或?qū)Ｒ坏?RNA 0.5-1 ug
注意：RNA 樣品不能含有基因組 DNA 污染。
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或隨機(jī)引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或 RNA 模板專一性引物 100 pmol
注意：隨機(jī)引物于 RNA 模板的比例跟 cDNA
合成的平均長度成反比,。
RNase-free 水 補(bǔ)水到 13 uL
2. 70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴,。
3. 再加入 5 uL RT Buffer（含 dNTP）。
4. 37℃保溫 5 分鐘,。對富含二級結(jié)構(gòu)的高 GC RNA 模板,，可以改成 45℃保
溫 5 分鐘。如果使用隨機(jī)引物,，則改成 25℃ 5 分鐘）,。
5. 加入 2 uL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），反應(yīng)終體積為 20uL,。
6. 42℃保溫 60 分鐘（但如果使用隨機(jī)引物,，需要先 25℃保溫 10 分鐘，然
后再轉(zhuǎn)移到 42℃保溫 60 分鐘）,。此步為 RT 反應(yīng),。
7. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，放置在冰上待用,。合成的 cDNA 可以用于
第二鏈 cDNA 的合成或放置在-20℃長期保存,。
三：用對照模板合成 cDNA(需要用同位素,，需要對照的客戶需要單獨(dú)跟天澤基因聯(lián)
系)
1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系:
對照 RNA 模板(0.5 ug/uL) 2 uL
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或隨機(jī)引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或?qū)φ找?2 uL
RNase-free 水 補(bǔ)水到 13 uL
2. 70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴。
3. 再加入 5 uL RT Buffer（含標(biāo)記 dNTP,，本試劑不提供）,。
4. 37℃保溫 5 分鐘。如果使用隨機(jī)引物,，則保溫溫度只能是 25℃,。
5. 加入 2 uL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），反應(yīng)終體積為 20uL,。
6. 42℃保溫 60 分鐘（但如果使用隨機(jī)引物,，需要先 25℃保溫 10 分鐘，然
后再轉(zhuǎn)移到 42℃保溫 60 分鐘）,。
7. 加 1uL 0.5M EDTA,，放置在冰上待用。
8. 電泳檢測,。合成的 cDNA 的量一般有加入 RNA 總量的 50%以上,，電泳一
般能出現(xiàn) 1.1Kb 的片段（如果使用隨機(jī)引物，將出現(xiàn)多個(gè)小片段）,。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 兩管式 RT-PCR 試劑盒（CAT#：80206）