副結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)試劑盒副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS)屬巴斯德氏菌科嗜血桿菌屬,，是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)且沒有運(yùn)動(dòng)性的小型,、多形性、
革蘭氏陰性桿菌。HPS 可引起豬多發(fā)性漿膜炎,、關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致體溫升
高,、呼吸困難甚至死亡, 給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,。目前對(duì) HPS 的診斷
主要是細(xì)菌分離培養(yǎng)和 PCR。HPS 培養(yǎng)需要 NAD,、馬血清和 5% CO2 環(huán)境,，
需 24-36 小時(shí)，還容易出現(xiàn)雜菌污染,，因此 PCR 是目前診斷 HPS zui常用的
方法,。本產(chǎn)品就是基于 PCR 的 HPS 檢測(cè)試劑盒，

副結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1. 靈敏度高,，分析靈敏度可以達(dá)到 50 拷貝/uL,，遠(yuǎn)高于細(xì)菌培養(yǎng)法。
2. 特異性高,，根據(jù) HPS 的 16S rDNA 基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,，可擴(kuò)增出強(qiáng)、
中和弱毒力的各種 HPS 血清型,，但不會(huì)誤檢豬鏈球菌 2 型,、豬傷寒沙門
氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等常見無關(guān)細(xì)菌,。
3. 一管封閉式,，避免了 PCR 產(chǎn)物對(duì)后續(xù) PCR 的污染。
4. 線性范圍廣,，在 10-107拷貝/uL 的靶分子濃度范圍內(nèi)均呈線性,。
5. 簡(jiǎn)單快捷，只需要 2 小時(shí)即可得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
規(guī)格及成分 成 份 50 次塑料袋包裝
即用型熒光 PCR Mix 750 uL
HPS 專一性引物對(duì) 100 uL
HPS 陽性對(duì)照 50 uL
超純水 1 mL
使用手冊(cè) 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,、-20℃保存，有效期一年,。
自備試劑 樣品,。
使用方法 一、樣品 DNA 的制備
用自選方法純化 HPS 樣品的 DNA,，也可以另購(gòu)本公司的細(xì)菌 DNAout
或柱式細(xì)菌 DNAout,，上述兩款產(chǎn)品跟本試劑盒兼容。
二,、制備 HPS 標(biāo)準(zhǔn)曲線
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 1,2,3,4,5 和 6 號(hào)。
2. 用帶芯分別加入 45 uL 超純水（zui用帶芯槍頭，下同）,。
3. 在 1 號(hào)管中加入 5 uL HPS 陽性對(duì)照(本試劑盒提供),，充分震蕩 1 分鐘。
4. 換槍頭,，從 1 號(hào)管中取 5 uL 溶液到 2 號(hào)管中,，充分震蕩 1 分鐘。
5. 換槍頭,，從 2 號(hào)管中取 5 uL 溶液到 3 號(hào)管中,，重復(fù)上面的操作直到得到
6 個(gè)稀釋度的樣品。
6. 從 6 個(gè)管中分別取 5 uL 進(jìn)行定量 PCR（見下步）,，每個(gè)樣品zui重復(fù) 3
次,。
三、熒光定量 PCR 反應(yīng)（30 uL 體系）
7. 在 PCR 管中加入下列成分（每個(gè)樣品zui重復(fù)三次,，這里只列出一次）：
成 份 樣品
6 個(gè)陽性對(duì)照（見制
備 HPS 標(biāo)準(zhǔn)曲線）
陰性對(duì)照
HPS 專一性引物對(duì) 2 uL 2 uL 2 uL
樣品 DNA 5 uL 無 無
HPS 陽性對(duì)照 無
5 uL（每個(gè)管加一
個(gè)稀釋度的對(duì)照） 無
自備 1×ROX (見注) 2 uL 2 uL 2 uL
補(bǔ)超純水到 15 uL 15 uL 15 uL
即用型熒光 PCR Mix 15 uL 15 uL 15 uL
注：僅 ABI7500,、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照，其他熒光
PCR 儀器（如 iCycler IQ,、MJ Option,、MJ Chromo4、MX3000,、MX4000,、
RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX,。
此處陰性對(duì)照用的是水,，用戶也可以用其他大腸桿菌基因組 DNA 做陰性對(duì)照。
8. 輕柔混勻后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行定量 PCR,，反應(yīng)參數(shù)如下：
過程 溫度 時(shí)間 其他
預(yù)變性 95℃ 5 分鐘
PCR 反應(yīng)
（40-50 個(gè)循環(huán)）
95℃ 20 s
62℃ 20 s
收集熒光數(shù)據(jù)，所
選擇波長(zhǎng)見注,。
68℃ 20 s
溶解曲線分析判斷產(chǎn)
物特異性
加熱到 95℃ 10 分鐘,，然后降低到 55℃后，
按 0.5℃/10s 的升幅將溫度提高到 95℃,，
其間記錄下熒光信號(hào)的變化,。特異的 HPS
PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物將在 84.5℃產(chǎn)生特異峰。
注：本產(chǎn)品所用熒光染料跟 DNA 結(jié)合時(shí)的zui大光吸收是 500 nm,，zui大發(fā)射
波長(zhǎng)是 530 nm,，不能 DNA 結(jié)合時(shí)zui大吸收波長(zhǎng)是 471 nm，無發(fā)射,。
四,、數(shù)據(jù)處理
9. 以 HPS 陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。
本試劑盒提供的陽性對(duì)照濃度為 XXX 拷貝/uL,，所以 1-6 管中的稀釋樣
品濃度可以由此計(jì)算出來。再用濃度的的 log 為橫軸,，以 Ct 值為縱軸,，
通過待測(cè)樣品的 Ct 值反推出樣品 DNA 的濃度。
10. 如果沒有自己做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，可以用本試劑的經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：
Ct=-3.4logX+25.4, 用戶將樣品所測(cè) Ct 值放入方程式即可計(jì)算出 X（樣
品 DNA 濃度）。此法不是非常準(zhǔn)確,，因?yàn)閮x器型號(hào),，試劑，操作誤差等都
會(huì)影響結(jié)果,。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 犬瘟熱細(xì)菌 RT-PCR 試劑盒（CAT#：11-CDV-50）,。