即用型熒光定量PCR試劑盒產(chǎn)品是基于熒光染料檢測(cè)的即用型 PCR 試劑盒，可以對(duì)基因組 DNA 靶
序列和 RNA 反轉(zhuǎn)錄后 cDNA 靶序列進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 分析（quantitativePCR,、qPCR）,。

即用型熒光定量PCR試劑盒本產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、優(yōu)化的 Taq DNA 聚合酶,、
dNTPs,、MgCl2、SYBR Green I 和穩(wěn)定劑等成分,。本產(chǎn)品中優(yōu)化的 Taq DNA
Polymerase 高溫加熱前,，抗 Taq 單克隆抗體與 Taq 結(jié)合，抑制 Taq 聚合酶活
性,，從而抑制在低溫條件下出現(xiàn)的由引物和模板 DNA 之間的非特異性雜交或引
物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增,。而且抗體在 PCR 反應(yīng)的預(yù)變性步驟中能*失
活，不會(huì)阻礙之后 Taq DNA 聚合酶的活性,，大大提高了 PCR 反應(yīng)的靈敏度及
特異性,。
1. 方便,，用戶只需準(zhǔn)備模板和引物既可以進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 實(shí)驗(yàn)。
2. 使用抗 Taq 抗體封閉的優(yōu)化的 Taq DNA 聚合酶,，可抑制低溫條件下的非特
異性擴(kuò)增,。
3. 使用第三代飽和型熒光染料，信號(hào)強(qiáng),，不會(huì)抑制 PCR 反應(yīng),。
4. 快捷，即用型的預(yù)配液使加樣操作步驟大大簡(jiǎn)化,，避免了交叉污染,，降低實(shí)
驗(yàn)誤差。
5. 各成分的濃度和比例都經(jīng)過精心優(yōu)化,，反應(yīng)的靈敏度高,，特異性強(qiáng)。能檢測(cè)
到濃度為 50 拷貝/mL 的靶分子,。
規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 1 mL 包裝 6 mL 包裝
qPCR MagicMix,，2× 90408 1 mL（棕色管） 6×1 mL（棕色管）
使用手冊(cè) 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 保存期限為 6 個(gè)月,。
自備試劑 DNA 模板,、引物、超純水,。
使用方法 1. 以 20 uL 的 qPCR 反應(yīng)體系為例：在一干凈的 PCR 管中,，加入下列成分：
反應(yīng)體系成分 20 uL 體系 終濃度
qPCR MagicMix，2× 10 uL 1×
自備引物一 a x uL 0.1-0.5 uM
自備引物二 a x uL 0.1-0.5 uM
自備模板 a x uL
自備 ROXb 2 uL （可以不加）
補(bǔ)超純水到 20 uL
放入熒光 PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增, 并在退火或延長(zhǎng)步驟中記錄熒光信號(hào),。
注意：
a) 通常引物濃度以 0.2 μM 可得到較好結(jié)果,，可以終濃度 0.1-1.0 μM 作
為設(shè)定范圍的參考；通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因組 DNA 或
1-10 ng cDNA 為參照,，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不
同,，可對(duì)模板進(jìn)行梯度稀釋，以確定*的模板使用量,。
b) ROX 校正染料：如果使用 ABI 公司的 7500,，7700 和 7900 三種型
號(hào)的熒光 PCR 儀器，則需用自備的 ROX 進(jìn)行 Ct 值校正,。對(duì) ABI 7700
和 7900,，ROX 的*濃度為 1×（即在每 20 uL 反應(yīng)體系中加 2 uL
10×ROX）。對(duì) ABI 7500,， ROX 的*濃度為 0.05-0.1×（每 20
uL 反應(yīng)體系加 0.1-0.2 uL 10×ROX,；也可將 10×ROX 稀釋到 1×，
然后每個(gè)反應(yīng)體系加入 1-2 uL 1×ROX）,。ROX 會(huì)在溶解曲線中產(chǎn)生
噪音,，因此,，如果出現(xiàn)了雜峰，將軟件中“Passive Reference Dye”
中的“ROX”選項(xiàng)取消打勾,，然后重新分析數(shù)據(jù),。
對(duì)于 iCycler IQ，MJ Opticon,，MJ Chromo4,，MX3000，MX4000,
RotorGene3000,，RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型號(hào)的
熒光 PCR 儀器,，ROX 不是必須的，但加入的話也不會(huì)影響整個(gè) PCR
分析,。
2. 循環(huán)步驟：根據(jù)擴(kuò)增子的性質(zhì)和儀器性能,，從以下三個(gè)過程中任選一個(gè)進(jìn)行
擴(kuò)增,。
A：兩步快速循環(huán)法：適用于引物 Tm 值設(shè)計(jì)為 60℃的反應(yīng)
循環(huán)步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數(shù)
酶活化 95℃ 2-5 min 1
變性
退火&延伸
95℃
60℃
15 s
1 min
35-40
注意：本產(chǎn)品所采用的酶在預(yù)變性 95℃,、2-5 min 條件下實(shí)現(xiàn)酶的活化。
退火溫度請(qǐng)以 60-64℃作為設(shè)定范圍的參考,，發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí),，可適當(dāng)
提高退火溫度。
B：三步快速循環(huán)法：適用于延伸步驟溫度高于退火步驟的 PCR（長(zhǎng)引物
PCR）
循環(huán)步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數(shù)
酶活化 95℃ 2-5 min 1
變性
退火
延伸
95℃
56-64℃
72℃e
15 s
30 s
30 s
35-40
注意：退火溫度：建議采用兩步法 PCR,，退火溫度 60℃進(jìn)行反應(yīng),。若提高
反應(yīng)特異性，可提高退火溫度,，以 60-64℃作為設(shè)定范圍的參考,。若因使用
Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí),，可嘗試進(jìn)行三步法PCR
擴(kuò)增,，三步法的退火溫度請(qǐng)以 56℃-64℃的范圍作為設(shè)定參考。延伸溫度：
延伸溫度設(shè)為 72℃通?？梢蕴岣邤U(kuò)增效率,。但是，對(duì)于 AT 含量大于 70%
的擴(kuò)增子來說,，延伸溫度設(shè)為 60℃為宜,。
C：通用循環(huán)法：這種循環(huán)方法適用于幾乎所有的熒光 PCR 儀，也適用于用
快速循環(huán)法不能擴(kuò)增的模版,。
循環(huán)步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數(shù)
酶活化 95℃ 5 min 1
變性
退火&延伸
95℃
60℃
15 s
60 s
35-40
3. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行,。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在沒結(jié)合
DNA 時(shí)，zui大吸收光譜在 471nm,，結(jié)合 DNA 時(shí)的zui大吸收光譜在 500nm,，
zui大發(fā)射光譜在 530nm,。
注意事項(xiàng) 1. 如果使用 iCycler，可以不加入 FAM,。
2. 如果使用 Roche LightCycler 的玻璃毛細(xì)管進(jìn)行 PCR,，需加入終濃度為
0.5mg/mL 的自備 BSA。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 即用型 PCR2.0,、PCR 級(jí)綠如藍(lán)染料,。