結(jié)核桿菌熒光定量PCR試劑盒適用于絕大多數(shù)致病性結(jié)核桿菌。它具有下列特點(diǎn)：1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,，操作簡單，定量準(zhǔn)確快速,。2. 根據(jù) TB 基因的保守序列設(shè)計引物,，引物經(jīng)過優(yōu)化，特異性高,。預(yù)期的 PCR產(chǎn)物長度為 111 bp,。

世界上大約 30%的人口感染過結(jié)核桿菌（TB），每年 TB 新增患者 900 多萬,，死亡病例達(dá) 170 萬,。TB 的病原菌主要分為人型結(jié)核桿菌和牛分枝桿菌，近年來又出現(xiàn)了結(jié)核桿菌復(fù)合群（MTC）變異株,。結(jié)核桿菌熒光定量PCR試劑盒即是基于熒光探針 PCR 法的 TB
核酸的快速檢測試劑盒,，適用于絕大多數(shù)致病性結(jié)核桿菌。

結(jié)核桿菌熒光定量PCR試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,，操作簡單，定量準(zhǔn)確快速,。
2. 根據(jù) TB 基因的保守序列設(shè)計引物,，引物經(jīng)過優(yōu)化，特異性高,。預(yù)期的 PCR
產(chǎn)物長度為 111 bp,。
3. 采用了改良后的 Taq Polymerase，具有高擴(kuò)增效率,，高擴(kuò)增靈敏度,，高擴(kuò)增
特異性的特點(diǎn)。
4. 本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷。 規(guī)格及成分 成分 編號 小扁盒包裝
qPCR Mix（with dye）,，2× 11-180201a 500 μL
TB 專一性引物對 yw13791380 100 μL
TB 陽性對照（1×10E10 拷貝/μL） yw13811382 10 μL
超純水 100935 1 mL
使用手冊 11-171201sc 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限一年,。 自備試劑 樣品等
使用方法 一,、樣品 DNA 的制備 j
用自選方法提取待測樣品的總 DNA,。注意：待測樣品的 DNA 純化方法是決定
檢測靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品 DNA,，后面的 PCR 再靈敏也
不能提高整體檢測靈敏度,。
二、制備 TB 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線（以 10-10E6 這 6 個 10 倍稀釋度為例,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃
度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品
或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)
品不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的,、可以直接使用的 DNA
片段作為陽性對照,。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6,，5,，4，3,，2 和 1 號,。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（zui用帶芯槍頭，下同）,。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用超純水 10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：
請不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至 10E7 拷貝/μL,，建議每次稀
釋 10 倍梯度稀釋，梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL）,。
4. 在 6 號管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的 TB 陽性對照(上步稀釋所得),，充
分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的 TB 陽性對照,。
5. 換槍頭,，從 6 號管中取 5 μL 溶液到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘,，得 10E5
拷貝/μL 的 TB 陽性對照,。
6. 換槍頭，從 5 號管中取 5 μL 溶液到 4 號管中,，得 10E4 拷貝/μL 的 TB 陽
性對照,。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 10E3 拷貝/μL 、10E2 拷貝/μL 和 10E1 拷貝/μ
L 三個稀釋度的 TB 陽性對照,。
8. NC 管中不加任何陽性對照,。
9. 從 1-6 號管中分別取 5 μL 和待測樣品一起進(jìn)行定量 PCR（見下步），每個
樣品做 3 次重復(fù)。
三,、qPCR 檢測（20 μL 體系）
1. 在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復(fù),，下表只列出一次）：
成分 樣品
陽性對照
1-6 管
陰性對照
qPCR Mix（含染料），2× 10 μL 10 μL 10 μL
樣品 DNA(10-100ng) 1-5 μL 不加 不加
TB 陽性對照
(10E1-10E6 拷貝/uL)
不加 5 μL/管 不加
自備 50×ROX 或 ROX II (見注) 0.4 μL 0.4 μL 0.4 μL
TB 專一性引物對 2 μL 2 μL 2 μL
補(bǔ)水 到 20 μL 到 20 μL 到 20 μL
注: 需要 ROX 的機(jī)型：ABI Prism 7000,、7300,、7700、7900HT,、Step One,、Step
One Plus。
需要 ROX II 的機(jī)型：ABI Prism 7500,、7500 Fast,、MJ Research Chromo4、Opticon,、
Corbett Rotor Gene 3000,、Agilent Mx3000P。
不 需 要 ROX 的 機(jī) 型 ： iCycler IQ ,、 MX3000 ,、 MX4000 、 RotorGene 6000 和
LightCycler480,。
2. 上機(jī),，請按照不同熒光定量 PCR 儀器的使用手冊設(shè)置如下 PCR 反應(yīng)參數(shù):
步驟 溫度 時間
酶活化 95℃ 120 s
PCR 反應(yīng)
（40 個循環(huán)）
95℃ 30 s
60℃ 30 s
72℃ 30 s
溶解曲線分析
3. 數(shù)據(jù)采集
檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交所產(chǎn)生的熒光信號，獲取數(shù)據(jù),。
四,、數(shù)據(jù)處理
以 6 個 TB 基因陽性對照濃度（10E1-10E6 拷貝/uL）的 log 值為橫軸，以 Ct
值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值為縱軸，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計
算出樣品 DNA 的濃度,。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 豬傳染性胃腸炎病毒 RT-PCR 檢測試劑盒（CAT#:11-210）
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