禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測試劑盒犬副流感病毒（Canine Parainfluenza Virus，CPIV）可以引起犬副流感,，這是犬的主要的呼吸道傳染病,。臨床表現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽,、流涕等癥狀,。病理變化以卡他性鼻炎和支氣管炎為特征。研究表明,，犬副流感病毒也可引起急性腦髓
炎和腦內積水,，臨床表現(xiàn)后軀麻癖和運動失調等癥狀。傳統(tǒng)診斷方法主要有病
毒的分離鑒定,、免疫熒光抗體試驗,、免疫電鏡觀察和 ELISA 等方法。但這些方
法操作過程繁瑣、操作難度大,，所需要時間較長,，專一性不強因此建立一種快
速、高靈敏度的診斷方法對防治犬副流感病毒是十分必要的,。本產品就是針對
這一需求開發(fā)的實時定量 RT-PCR 產品,，

禽流感病毒H5亞型熒光RT-PCR檢測試劑盒具有下列特點：
1. 靈敏度高，分析靈敏度可以達到 50 拷貝/uL,，遠高于常規(guī)方法,，也比常規(guī)
的 RT-PCR 檢測高 100 倍。
2. 特異性高,，根據 CPIV 的保守區(qū)設計引物,，不會誤檢其他豬的病原性病毒
3. 一管封閉式，避免了 RT-PCR 產物對后續(xù) RT-PCR 的污染,。
4. 線性范圍廣，在 10-10
7拷貝/uL 的靶分子濃度范圍內均呈線性,。
5. 簡單快捷,，只需要 2 小時即可得到實驗結果。 規(guī)格及成分 成 份 編 號 十孔盒包裝
即用型熒光 RT-PCR Mix 101219 750 uL
CPIV 專一性引物對（25uM each） Yw14141415 100 uL
CPIV 陽性對照片段（10E10 拷貝/uL） Yw14161417 10 uL
CPIV 探針（5.4nM,，5FAM-3HBQ1） Yw1418 25 uL（棕色）
超純水 100935 1 mL
使用手冊 1 份 1 份
運輸及保存 低溫運輸,、-20℃保存，有效期一年,。 自備試劑 樣品,。 使用方法 一、樣品 RNA 的制備
用自選方法純化犬副流感病毒樣品的 RNA,，也可以另購本公司的病毒RNAout
或柱式病毒 RNAout,，上述兩款產品跟本試劑盒兼容。
二,、制備 CPIV 陽性片段的不同稀釋樣品（以制備 10-10E6 這 6 個 10 倍稀釋度
為例,。先將對照從 10E10 稀釋到 10E7 拷貝/uL。由于標準品濃度非常高,，因此
下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他
成分）。
1. 標記 6 個離心管,，分別為 1,2,3,4,5 和 6 號,。
2. 用帶芯分別加入 45 uL 超純水（zui用帶芯槍頭，下同）,。
3. 在 6 號管中加入 5 uL 濃度為 10E7 的 CPIV 陽性片段,，充分震蕩 1 分鐘。
4. 換槍頭，從 6 號管中取 5 uL 溶液到 5 號管中,，充分震蕩 1 分鐘,。
5. 換槍頭，從 5 號管中取 5 uL 溶液到 4 號管中,，重復上面的操作直到得到 6
個稀釋度的樣品,。1-6 號管中陽性對照片段的濃度分別為 10E1 到 10E6 拷貝
/uL。
6. 從 6 個管中分別取 5 uL 進行定量 RT-PCR（見下步）,，每個樣品zui重復 3
次,。
三、熒光定量 RT-PCR 反應（30 uL 體系）
7. 在 PCR 管中加入下列成分（每個樣品好重復三次,，這里只列出一次）：
成 份 樣品
6 個陽性對照
稀釋梯度
陰性對照
CPIV 專一性引物對 2 uL 2 uL 2 uL
CPIV 專一性探針） 0.5uL 0.5uL 0.5uL
樣品 RNA（自備） 5 uL 無 無
CPIV 陽性對照 無
5 uL（每個管加一個
稀釋度的對照）
無
補超純水到 15 uL 15 uL 15 uL
即用型熒光 RT-PCR Mix 15 uL 15 uL 15 uL
8. 輕柔混勻后上機,，按下面參數(shù)進行定量 RT-PCR，反應參數(shù)如下：
過程 溫度 時間 其他
RT（逆轉錄） 37℃ 30 分鐘
預變性 95℃ 5 分鐘
PCR 反應
（40 個循環(huán)）
95℃ 30 s
49℃ 30 s
72℃ 30 s 采集數(shù)據
溶解曲線分析判斷產
物特異性
加熱到 95℃ 10 分鐘,，然后降低到 55℃后,，
按 0.5℃/10s 的升幅將溫度提高到 95℃，
其間記錄下熒光信號的變化,。特異的 CPIV
PCR 擴增產物將在 82.2℃產生特異峰,。
注意：儀器將檢測擴增產物與探針雜交所產生的熒光信號，獲取數(shù)據,。熒光
通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，
請勿選擇 ROX 參比熒光,。
四,、數(shù)據處理
9. 以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標準曲線,。再以待
測樣品濃度的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，通過待測樣品的 Ct 值計算出
樣品 DNA 的濃度,。。 關聯(lián)產品 豬傳染性胃腸炎病毒 RT-PCR 試劑盒（CAT#：11-TGEV-50）,。