天凈沙DNA甲基化修飾試劑盒血液樣品和各種臨床樣品（包括組織檢查、FFPE 切片或少量細胞樣品）都是基因表達分析和診斷的常見材料,，但這些樣品通常數(shù)量有限,，質量不高，并且還沒
法進行第二次取樣,。所以得到足夠 RNA 量供后續(xù)試驗是一個非常棘手的瓶頸,。為解
決這一問題，

天凈沙DNA甲基化修飾試劑盒本公司根據(jù) Ribo-SPIA 技術,，開發(fā)了本產(chǎn)品,。Ribo-SPIA 技術的核心
是利用隨機和帶 oligo dT 尾巴的 DNA/RNA 嵌合引物，以完整或降解的總 RNA 為
模板進行逆轉錄并得到雙鏈 cDNA,、RNase H 不間斷地在 cDNA 第 1 鏈中的 RNA
部分產(chǎn)生裂口,，DNA 聚合酶以此裂口為基礎進行鏈取代聚合反應，產(chǎn)生 cDNA 單鏈,。
此技術原理圖如下：
具有下列特點：
1. 能用 500pg-50ng 總 RNA 模板擴增得到 ug 級別的單鏈 cDNA,。
2. 步驟簡單方便，擴增在恒溫進行,，只需要 5 個小時,，不需要特殊儀器設備。
3. 保真性好,，保持 RNA 樣品中各分子的相對豐度,。
4. 完整或降解的 RNA 均可作為模板，尤其適用于 RNA 產(chǎn)量和質量都不高的樣品,。
但降解 RNA 作為模板時產(chǎn)量低,，且擴增產(chǎn)物長度比較短。
5. 擴增得到的單鏈 cDNA 能直接用于各種后續(xù)試驗,，包括 qPCR,、芯片表達分析、
雜交反應等,。
6. 本產(chǎn)品足夠做 10 次雙鏈 cDNA 的合成,，20 次 SPIA 擴增,。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 20 次塑料袋包裝
cDNA 一鏈合成緩沖液 130308A 40 uL
MMLV 逆轉錄酶 60905 10 uL
cDNA 二鏈合成緩沖液，5× 130308B 160 uL
cDNA 二鏈合成酶混合液 20× 130308C 40 uL
SPIA RT 引物混合液 Yw11931204 40 uL
SPIA 反應液,，5× 131083A 320 uL
SPIA 擴增引物 Yw1192 320 uL
SPIA 酶混合液 131083D 120 uL
超純水 100935 1 mL
使用手冊 1 份

運輸及保存 低溫運輸,，-20℃保存，有效期為 1 年,。
使用方法 一：樣品 RNA 的制備
不含 RNA 制備相關試劑,，用作模板的每個批次的 RNA 樣品zui先做一
個預實驗?？?RNA 樣品的濃度必須在 1-20ng/uL,，一次反應所需總 RNA 的量為
500pg-50ng。過低則需要濃縮,，過高則需要用無 RNase 的水稀釋。RNA 不能含
DNA,、蛋白質和殘留有機溶劑（如酚和乙醇）污染,。尤其是要去除 DNA 污染，因
為 DNA 也可以被擴增,，同時其存在會干擾 RNA 濃度測定的準確性,。Trizol 提取的
RNA 常含殘留的酚和乙醇，故zui用柱式方法再純化一次,。微量提取時不能使用核
酸類的助沉劑,。RNA 的 RIN 值zui在 2 以上。
二：一管式雙鏈 cDNA 的合成
1. 在 0.5mL PCR 管中,，按下表配制雙鏈 cDNA 合成反應,。注意：zui每次實驗
設置一個陰性對照組，在此對照中用超純水替代自總 RNA:
成分 用量
自備的總 RNA 4 uL（500pg-50ng）
SPIA RT 引物 Mix 20uM 1 uL
65℃ 5 分鐘后室溫放置 2 分鐘,，短暫離心后放 4℃
cDNA 一鏈合成緩沖液 4 uL
MMLV 逆轉錄酶 1 uL
輕柔吹打混勻后放冰上,，然后 4℃ 2 分鐘，25℃ 30 分鐘,，42℃
15 分鐘,，70℃ 15 分鐘，zui后 4℃短暫放置后加入下列成分,，
得到 80uL 的 cDNA 第二鏈合成反應體系,。
超純水 50 uL
cDNA 二鏈合成緩沖液 16 uL
cDNA 二鏈合成酶混合液 4 uL
輕柔吹打混勻后，短暫離心,，4℃保溫 1 分鐘,，25℃保溫 10 分
鐘，50℃保溫 30 分鐘,，80℃保溫 20 分鐘,，zui后 4℃放置待用
三：SPIA 擴增（120uL 反應體系）
2. 在 0.5mL PCR 管中,，按下表配制 120uL 的 SPIA 反應體系。注意：zui設置
兩個陰性對照組,，在此兩個對照中分別用超純水替代 SPIA 引物和 cDNA 雙鏈
反應液,。
成分 用量
cDNA 雙鏈反應產(chǎn)物 40 uL(來于上步)
SPIA 擴增引物 16 uL
SPIA 反應液，5× 16 uL
超純水 42 uL
94℃20 秒后 50℃放置復性待用
SPIA 酶混合液 6 uL
輕柔吹打混勻后得到 120 uL 反應體系,，4℃保溫 1 分鐘,，47℃
保溫 75 分鐘，95℃保溫 5 分鐘,，zui后 4℃放置待用
四：SPIA 擴增產(chǎn)物的檢測
3. 取 5uL SPIA 擴增產(chǎn)物進行 PAGE 電泳檢測,。標準的反應結果是產(chǎn)生長度在
200-2000bp 之間的產(chǎn)物。
4. 如果產(chǎn)物將用于 PCR 定量,，則可以不經(jīng)過純化直接使用,，如果需要用于芯片雜
交和濃度測定，則需要按常規(guī)的方法純化 cDNA 以便去除殘留的 dNTP 和引物,。
5. OD 檢測純度和濃度,。在 OD260 的波長下測樣品你給的光吸收。由于擴增產(chǎn)
物是單鏈 DNA,，故 1OD260=33ug/mL,。
6. 所得 DNA 可以放-20℃長期放置。
關聯(lián)產(chǎn)品 天凈沙 Ribo-SPIA cDNA 擴增試劑盒（CAT#：131083）