一站式TA克隆試劑盒（B）AT克隆就是利用T載體兩個(gè)3’端各帶有一個(gè)T突出,，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩個(gè)3’端各帶有一個(gè)A突出的特點(diǎn)，在DNA連接酶的作用下,，將PCR產(chǎn)物克隆到T載體中的過程,，它是克
隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的主要手段

一站式TA克隆試劑盒（B）AT克隆就是利用T載體兩個(gè)3’端各帶有一個(gè)T突出，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩個(gè)3’端各帶有一個(gè)A突出的特點(diǎn),，在DNA連接酶的作用下,，將PCR產(chǎn)物克隆到T載體中的過程，它是克
隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的主要手段,。本產(chǎn)品提供了完成AT克隆的所有成份,，具有下列特點(diǎn)：
1. 一站式，用戶只需要準(zhǔn)備PCR產(chǎn)物即可進(jìn)行AT克隆,。
2. T載體由Xcm I酶切方法制備,，兩個(gè)5’端100%含T突出，自連率幾乎為零。
3. 克隆效率高,，一次AT克隆實(shí)驗(yàn)一般能得到上百個(gè)重組子,。
4. 陽性率高，一般能到90%以上, 大大縮短了篩選工作,。
5. 提供供兩次實(shí)驗(yàn)用的對(duì)照插入片段,，方便分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
6. 插入位點(diǎn)兩側(cè)有對(duì)稱的常見酶切位點(diǎn)（如EcoR I）,，便于對(duì)克隆的PCR片段進(jìn)行近
一步的分析,。
7. 克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別有T3和T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子, 便于用克隆的PCR片段制備RNA
探針。
8. 可以使用pUC/M13 Forward和Reverse測序引物測定插入片段的序列,。
9. T克隆位點(diǎn)位于β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區(qū)內(nèi),，可以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。
10.含有絲狀噬菌體f1 復(fù)制起始子,，可以制備單鏈DNA,。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 20 次塑料袋包裝
即用型藍(lán)白 T 載體（50 ng/uL） 20 uL
對(duì)照插入片段（50 ng/uL） 5 uL
T4 快速連接緩沖液，2× 100 uL
T4 DNA 連接酶（5 U/uL） 30 uL
超純水 100935 1 mL
高效感受態(tài)細(xì)胞 100 uL×10 只(只 B 型有)
使用手冊(cè) 90801sc 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存,，有效期一年。感受態(tài)細(xì)胞需要干冰運(yùn)輸,，-70℃保存,，有效期 6 個(gè)
月,。
自備試劑 插入片段
一站式TA克隆試劑盒（B）使用方法 一： PCR產(chǎn)物的純化和定量注意事項(xiàng)
1. 由于PCR體系中有大量會(huì)抑制DNA連接反應(yīng)的dATP,、還有一些可能在電泳膠上不
一定會(huì)顯示出來的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，所以PCR產(chǎn)物必須用膠回收方
法制備才能用于本試劑盒的連接,?？梢苑謩e使用本公司柱式DNABACK
（CAT#:60202）和PAGE DNAback（包括柱式PAGE DNAback）從瓊脂糖膠
和PAGE膠上純化回收PCR片段。具體操作見相關(guān)產(chǎn)品使用手冊(cè),。
2. 瓊脂糖膠回收的電泳緩沖液zui不要使用TBE緩沖液,，因?yàn)樗鼤?huì)影響DNA的膠回收
效率。
3. 為避免UV對(duì)DNA的傷害,，切膠zui在日光下進(jìn)行（使用天恩澤基因的綠如藍(lán)染料
的話,，可以直接在黑色背景下看見DNA條帶，不需要紫外光）,。如果使用EB或其
他染料,，必須在紫外下切膠時(shí)，zui選擇長波(360 nm)紫外燈并以zui快速度切膠,，
文獻(xiàn)報(bào)道短波UV（300 nm 和240 nm）會(huì)使DNA連接效率降低400多倍,。使用
短波UV時(shí)，可以使用天恩澤基因的DNA防護(hù)劑UV Erasol（CAT#：60601）減少
傷害。
4. PCR片段的體積越小越便于后續(xù)操作,。洗脫P(yáng)CR片段時(shí),，用zui少量的洗脫液洗脫。
本試劑盒要求PCR回收片段的濃度zui為50ng/uL,。如果濃度不夠,，zui用醇沉
淀法沉淀后直接在管內(nèi)設(shè)置連接反應(yīng)，也可以使用本公司的核酸濃縮劑（CAT#：
110801-30）直接濃縮,。
5. 為準(zhǔn)確定量回收的PCR產(chǎn)物同時(shí)又節(jié)約樣品,，zui使用微量分光光度計(jì)（只需用1
uL樣品測量）。如果分光光度計(jì)需要大量樣品,，建議使用電泳法定量：將回收的
PCR片段與濃度已知的DNA Marker在含EB或綠如藍(lán)染料的瓊脂糖凝膠中電泳,，
通過比較DNA條帶的相對(duì)熒光強(qiáng)度而估測PCR產(chǎn)物的濃度。
二：連接反應(yīng)
1. 短暫離心裝有藍(lán)白T載體,、連接緩沖液和T4 連接酶的離心管,。
2. 在三個(gè)離心管中加入下列成分（注意，對(duì)照可以不做,，在出現(xiàn)問題時(shí)再做）：
成份 樣品管 陽性對(duì)照管 自連對(duì)照管
T4 快速連接緩沖液,，2× 5 uL 5 uL 5 uL
藍(lán)白 T 載體（50 ng/uL）
（=0.03 pmol/uL）
1 uL 1 uL 1 uL
自備 PCR 純化產(chǎn)物
(0.03-0.1 pmol/uL) X uL（見注） 不加 不加
對(duì)照插入片段（50 ng/uL）
（=0.06 pmol/uL）
不加 1.5 uL 不加
T4 DNA 連接酶（5 U/uL） 1-1.5 uL 1-1.5 uL 1-1.5 uL
超純水 補(bǔ)到 10 uL 補(bǔ)到 10 uL 補(bǔ)到 10 uL
注: 如何根據(jù)T載體的用量計(jì)算PCR純化片段的*用量？
*：確定插入片段與載體的*摩爾比,，在本產(chǎn)品的T載體的長度固定（3Kb）時(shí),，
*摩爾比跟插入片段的長度關(guān)系如下：
插入片段長度 與載體的摩爾比
1 Kb 以下 2：1 或 3：1
跟 T 載體接近（±1 Kb） 1 ：1
比 T 載體長 1Kb 或更多 1：2 或 1：3
第二：根據(jù)選定的*摩爾比按下面方程式計(jì)算用量
 (n g)
(k b)]
(n g) (k b) 插入片段和載體的摩爾比 插入片段的量 載體大小
加入載體的量 插和入片段大小
? ?
?
提供的T載體長度為3 Kb，推薦用量為50ng,，如果PCR片段長度為0.5 Kb,，
*摩爾比設(shè)定為3:1，則其用量為:
插和入片段 載體
載體 插入片段 3/1 25 ng
3.0 kb
50 ng 0.5 kb
? ?
?
3. 用移液器吹打連接反應(yīng)液使之混勻,，然后放置在16℃孵育30分鐘-過夜,。
4. 65℃5分鐘滅活連接酶后直接用于轉(zhuǎn)化或-20℃保存。
三：細(xì)菌轉(zhuǎn)化及篩選（僅供參考,，本產(chǎn)品不提供相關(guān)試劑）
1. 將100 μL轉(zhuǎn)化效率在1×108 cfu/µg以上的感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍,。
2. 取5-10 μL連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物,。
3. 在冰上放置30分鐘,。
4. 將離心管放42℃熱休克90秒，然后快速將其轉(zhuǎn)移到冰浴中放置1~2分鐘,。
5. 每管中加900 μL LB培養(yǎng)基,，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞。
6. 將100uL復(fù)蘇涂布到含Amp的LB瓊脂平板上（也可加上X-gal和IPTG）,。
7. 室溫4,000 rpm離心剩余的900 uL復(fù)蘇細(xì)胞5分鐘,，棄去800 μL上清,，用剩余100
μL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并涂布到含Amp的LB瓊脂平板上（可加X-gal、IPTG）,。
8. 將平板置于室溫直至液體被吸收,。此步非常重要，否則培養(yǎng)板將在37℃排除水分,，
細(xì)菌將隨水在培養(yǎng)基上到處游動(dòng),，不能形成單個(gè)菌落。
9. 倒置平皿,，于37℃培養(yǎng),，12~16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。一般情況下陽性對(duì)照組總共會(huì)
有上千個(gè)菌落（100 uL轉(zhuǎn)化液產(chǎn)生的菌落數(shù)×10）,，自聯(lián)對(duì)照只有少數(shù)幾個(gè)菌落,，
樣品組的菌落數(shù)取決于PCR回收片段的質(zhì)量。
10. 按常規(guī)方法篩選重組子,。