一站式生物素檢測TUNEL試劑盒（DAB法）TUNEL 就是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的 dUTP 切口及末端標記（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)，它是一種高靈,、敏度,、快速檢測細胞凋亡的方法。其原理是在發(fā)生凋亡細胞中會有大量的具有切口的DNA 片段,、或具有游離 3’-OH 端,、長度是 180-200 bp 倍數(shù)的 DNA 片段，
TdT (末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)可以以不依賴模板的方式進行標記,，如參入熒
光素,、生物素或等標記的 dUTP，而正常細胞 DNA 幾乎沒有游離的 3’
-OH 和切口,，所以通過對標記物的顯色反應和熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測
就可以區(qū)分正常和凋亡的細胞,。此過程的示意圖如下：
DNA 末端標記 DNA 切口標記
 一站式生物素檢測TUNEL試劑盒（DAB法）有如下特點：
1. 一站式，不需要額外準備的試劑（但客戶還是需要自備常規(guī)的試劑,，
如水,、PBS 和細胞涂片所需試劑）,。
2. 高靈敏度，可以在單細胞水平檢測到細胞凋亡,，適合檢測早期的細胞凋亡,。
3. 特異性高，只標記凋亡細胞,，而不標記壞死細胞,。
4. 快速，整個操作過程僅需 1-2 個小時即可完成,。
5. 方便,，一步染色反應，洗滌后即可觀察,，不必使用二抗等進行多步操作,。
6. 適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）,，
足夠處理十張切片使用,。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 10 次塑料袋包裝
1×TdT Buffer 81206A 0.5 mL
TdT 酶（20 U/uL） 81206B 10 uL
Proteinase K 溶液（200 ug/mL） 81206C 1 mL
Streptavidin-HRP 81206D 50 uL
DAB 干粉 81206E 1 mg
使用手冊 81026sc 1 份
運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存,，有效期一年
自備試劑 二甲苯,、多聚甲醛、PBS,、H2O2,、Triton X-100、檸檬酸鈉,、蘇木素染液,、
超純水。
使用方法 一：樣本預處理（操作步驟僅供參考,，本試劑盒不提供相關(guān)試劑）
下面所用的固定液,、淬滅液和通透液均需要新鮮配制。固定液是溶于 pH
7.4 的 PBS 中的,、濃度為 4%的多聚甲醛溶液,；淬滅液是用甲醇將 H2O2原
液（30%）稀釋到 3%而得；通透液是溶于 0.1%檸檬酸鈉中的,、濃度為 0.1%
的 Triton X-100 溶液,。
對貼壁細胞或細胞涂片
1. 將自然晾干的貼壁細胞或細胞涂片浸入固定液中室溫固定 30-60 分鐘,。
為改善細胞的滲透性,，可將固定好的樣本放在 70%乙醇中-20℃放置過
夜。為防止樣本脫落,，可使用硅烷處理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片,。
2. 用自備的 PBS 漂洗 2 次,，每次 5 分鐘。
3. 浸入淬滅液中室溫放置 10 分鐘后,，用 PBS 漂洗 2 次,，每次 5 分鐘。
4. 浸入通透液中,，冰上放置 2 分鐘后,，用 PBS 漂洗 2 次，每次 5 分鐘,。
用吸水紙吸干樣本周圍水分,。待用。
對石蠟組織切片
1. 將切片置于染缸中,，用二甲苯脫蠟 2 次,，每次 5 分鐘；再分別用 100%,、
95%,、90%、80%,、70%的乙醇和 PBS 各洗一次,，每次 3 分鐘。
2. 在每張切片上滴加 100 uL 蛋白酶 K工作液(10 uL 蛋白酶 K 溶液+90 uL
PBS 緩沖液)并在室溫放置 15-30 分鐘以降解交聯(lián)的蛋白和其他內(nèi)源蛋
白,。注意：蛋白酶 K 工作液的用量和處理時間一般都需根據(jù)樣品的不同
而單獨進行優(yōu)化,，此處的用量只供參考。蛋白酶 K 處理后不需要再淬滅
內(nèi)源蛋白酶,。
3. 用 PBS 漂洗 4 次,，每次 3 分鐘。此步不能省略,，否則殘留的蛋白酶 K 將
會降解后面降壓加入的 TdT,。用吸水紙吸干樣本周圍水分。待用,。
對冰凍切片
1. 將切片在固定液中室溫固定 20-60 分鐘,，PBS 洗滌 2 次，每次 10 分鐘,。
2. 浸入淬滅液中室溫放置 10 分鐘后,，用 PBS 漂洗兩次，每次 5 分鐘,。
3. 浸入通透液中冰上放置 2 分鐘后,，用 PBS 漂洗兩次，每次 5 分鐘,。用吸
水紙吸干樣本周圍水分,。待用,。
陽性對照樣本
1. 所有處理步驟跟樣品一樣，只是在zui后還需在樣品上滴加 100 μL 自備的
DNase I 反應液室溫放置 10-30 分鐘,。反應液含 40 mM Tris-HCl pH
7.9,，10 mM NaCl，6mM MgCl2,，10mM CaCl2和不同濃度的 DNase
I（冷凍切片需 3U/mL,、石蠟切片需 1500 U/mL、一般樣本需 10
U/mL）,。用 PBS 洗兩次,，每次 5 分鐘。用吸水紙吸干周圍水分后待用,。
二．標記和顯色反應
2. 配制所需量的 TdT 酶反應液：將 1 uL TdT 酶加入到 50 uL 1×TdT
Buffer 中即可,。TdT 酶反應液需即用即配，不宜保存,，否則酶會失活,。
3. 在除陰性對照外的每個樣本上滴加 50 uL TdT 酶反應液，加蓋玻片后
37℃避光放置 60 分鐘,。注意：加蓋玻片可使反應液均勻分布,，并避免其
揮發(fā)。陰性對照只滴加 50 uL 不含 TdT 酶的反應液,。
4. 用自備的 PBS 清洗 3 次,，每次 5 分鐘，用吸水紙吸干樣本周圍殘留液體,。
5. 將 5 uL Streptavidin-HRP 溶液加入 45 uL PBS 中,，混勻后全部加在
切片上并加蓋玻片，37℃避光放置 30 分鐘,。
6. 用自備的 PBS 清洗 4 次,，每次 5 分鐘，用吸水紙吸干樣本周圍殘留液體,。
7. 滴加 50 uL 新鮮配制的 DAB 工作液（將1 mg DAB干粉溶于 1 mL PBS
中,，取 50uL 與 1 uL 30% H2O2混合即得 DAB 工作液，剩余的 DAB
溶液可-20℃避光保存）,，室溫顯色 10 分鐘,。
8. PBS 漂洗 4 次，前 3 次每次 1 分鐘,，zui后 1 次 5 分鐘,。
9. 光學顯微鏡下觀察、拍照。亦可用蘇木素或甲基綠復染復染后再觀察,。
問題及解答 現(xiàn)象 可能原因 建議
非特異性
染色
Biotin-dUTP 非特異性結(jié)合 勿使細胞干涸
TdT 酶的濃度過高 將 TdT 酶稀釋 1-10 倍
內(nèi)源過氧化物酶未被淬滅 用淬滅液室溫淬滅 10 分鐘
內(nèi)源核酸酶或聚合酶活性高 取樣后立即固定
染色背景
較高
內(nèi)源過氧化物酶未被淬滅 用淬滅液室溫淬滅 10 分鐘
樣本被支原體污染 制備未被污染的新樣本
標記反應過強 將 TdT 酶稀釋 2-5 倍
細胞處于高度增殖期 在非高增殖期取樣檢測
DAB 孵育時間過長 減少 DAB 染色時間
標記率 固定劑（乙醇或甲醇）效果差 改用多聚甲醛或戊二醛
低、染色
淡至無
固定時間過長導致過度交聯(lián) 縮短固定時間
促滲條件不佳 增加通透劑促滲時間