乙型肝炎病毒（HBV）cccDNA PCR檢測(cè)試劑盒乙肝病毒共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）是乙肝病毒前基因組 RNA 復(fù)制的原始模板,，雖含量較少,，每個(gè)肝細(xì)胞內(nèi)只有約5～50 個(gè)拷貝，但對(duì)乙肝病毒的復(fù)制以及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義,，
只有清除了 cccDNA,，才能*消除乙肝患者病毒攜帶狀態(tài)。因此 cccDNA 的
檢測(cè)具有重要的臨床意義,，本產(chǎn)品即是乙肝病毒 cccDNA 快速檢測(cè)試劑盒,。它
乙型肝炎病毒（HBV）cccDNA PCR檢測(cè)試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供病毒 DNA 模板,。
2. 引物經(jīng)過(guò)優(yōu)化,，特異性高。
3. 熒光定量 PCR 檢測(cè),，qPCR Mix 所含 SYBR Green I 只與雙鏈 DNA 結(jié)合,，
反應(yīng)特異性強(qiáng),。
4. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷,。
規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 50 次塑料袋包裝
2×qPCR Mix 90408 1 mL
cccDNA 專一性引物對(duì) yw1000-1-2 100 μL
陽(yáng)性對(duì)照 1000-1-2 50 μL
RNase-free 水 80403 1 mL
使用手冊(cè) 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限一年,。
自備試劑 樣品等
使用方法 一,、樣品 DNA 的制備
用自選方法提取 HBV cccDNA。注意：病毒 DNA 純化方法是決定檢測(cè)靈
敏度的關(guān)鍵因素,。如果不能很好純化 HBV DNA,，后面的 PCR 再靈敏也不
能提高整體檢測(cè)靈敏度。
二,、制備 cccDNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線（以 10-10E6 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例,。由于標(biāo)準(zhǔn)
品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能污染
樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，
不提供活體病毒做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供沒(méi)有傳染性的,、可以直接使用的
DNA段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 6,，5，4,，3,，2 和 1 號(hào)。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（zui用帶芯槍頭,，下同）,。
3. 先將本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照用 TE 緩沖液或超純水 10 倍梯度稀釋到
10E7 拷貝/μL（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至 10E7
拷貝/μL，建議每次稀釋 10 倍,，梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL）,。
4. 在 6 號(hào)管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的 CPV 陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，
充分震蕩 1 分鐘,，得 10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,。
5. 換槍頭，從 6 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 5 號(hào)管中,，充分震蕩 1 分鐘,，得 10E5
拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。
6. 換槍頭，從 5 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 4 號(hào)管中,，重復(fù)上面的操作直到得到 6
個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照,。
7. NC 管中不加任何陽(yáng)性對(duì)照。
8. 從 1-6 號(hào)管中分別取 5 μL 和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量 PCR（見(jiàn)下步）,，每個(gè)
樣品做 3 次重復(fù),。PCR 后得到每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照稀釋樣品的熒光 PCR Ct 值，
并以之為縱軸,，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
三,、PCR 檢測(cè)（20 μL 體系）
1. 在 PCR 管中加入下列成分（待測(cè)樣品需要做三次重復(fù),，下表只列出一次）：
成分 樣品 陰性對(duì)照
2×qPCR Mix 10 μL 10 μL
待測(cè)樣品 DNA 模板 1-5 μL 無(wú)
陽(yáng)性對(duì)照 無(wú) 無(wú)
自備 10×ROX (見(jiàn)注) 2 μL 2 μL
專一性引物對(duì) 2 μL 2 μL
補(bǔ)水到 20 μL
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照,，其他熒光 PCR
儀器（如 iCycler IQ,、MJ Option、MJ Chromo4,、MX3000,、MX4000、
RotorGene 3000,、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX,。
2. 建議 PCR 反應(yīng)參數(shù)（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）
過(guò)程 溫度 時(shí)間
活化 94℃ 1 min
PCR 反應(yīng)
（40 個(gè)循環(huán)）
94℃ 10 s
60℃ 30 s
3. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合
DNA 時(shí),，zui大吸收光譜在 471 nm,，結(jié)合 DNA 時(shí)的zui大吸收光譜在 500 nm，
zui大發(fā)射光譜在 530 nm,。
四、數(shù)據(jù)處理
以 CPV 陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再
以待測(cè)樣品濃度的 log 為橫軸,，以 Ct 值為縱軸,，通過(guò)待測(cè)樣品的 Ct 值計(jì)
算出樣品 DNA 的濃度。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 即用型熒光定量 PCR 試劑盒（CAT#:90408）

大豆源性成分熒光PCR檢測(cè)試劑盒(探針?lè)?    11-180402
大米BT63基因PCR檢測(cè)試劑盒    11-850
大米CrylAc基因PCR檢測(cè)試劑盒    11-860
單純皰疹病毒II型PCR檢測(cè)試劑盒    11-880
單純皰疹病毒PCR檢測(cè)試劑盒    11-890
單增李斯特菌PCR檢測(cè)試劑盒    11-900
單增李斯特菌prfA基因(274bp)常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒    11-4440
單增李斯特菌prfA基因熒光PCR檢測(cè)試劑盒(探針?lè)?    11-445050
彈狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒    11-910
登革熱病毒PCR檢測(cè)試劑盒    11-980
登革熱病毒Ⅰ,、Ⅱ型PCR檢測(cè)試劑盒    11-920
登革熱病毒Ⅰ,、Ⅱ型分型PCR檢測(cè)試劑盒    11-930
登革熱病毒Ⅰ型PCR檢測(cè)試劑盒    11-940
登革熱病毒Ⅱ型PCR檢測(cè)試劑盒    11-950
登革熱病毒Ⅲ、Ⅳ型PCR檢測(cè)試劑盒    11-960
登革熱病毒Ⅲ,、Ⅳ型分型PCR檢測(cè)試劑盒    11-970
凋亡抑制蛋白Livin基因PCR檢測(cè)試劑盒    11-530
凋亡抑制蛋白Survivin基因PCR檢測(cè)試劑盒    11-540
丁型肝炎病毒巢式RT-PCR檢測(cè)試劑盒    11-102050
動(dòng)物源性成分(18S)PCR檢測(cè)試劑盒    11-1030
對(duì)蝦白斑病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒    11-104050
對(duì)蝦桿狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒    11-1050
多瘤病毒PCR檢測(cè)試劑盒    11-1060
鵝特定基因序列PCR檢測(cè)試劑盒    11-1070
鵝細(xì)小病毒PCR檢測(cè)試劑盒    11月1日
惡性瘧PCR檢測(cè)試劑盒    11-50
非洲馬瘟病毒PCR檢測(cè)試劑盒11-1     11月1日
非洲豬瘟病毒PCR檢測(cè)試劑盒    11-230
肺耐藥蛋白基因PCR檢測(cè)試劑盒    11-1110
肺炎鏈球菌PCR檢測(cè)試劑盒    11-1120
肺炎衣原體PCR檢測(cè)試劑盒    11-1130
肺炎支原體PCR檢測(cè)試劑盒    11-1140
肺炎支原體熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（染料法）    11-203
風(fēng)疹病毒PCR檢測(cè)試劑盒    11-1150
麩質(zhì)Gluten基因PCR檢測(cè)試劑盒    11-1160
副雞嗜血桿菌PCR檢測(cè)試劑盒    11-1170
副結(jié)核分枝桿菌PCR檢測(cè)試劑盒    11-1180
副結(jié)核桿菌PCR檢測(cè)試劑盒    11-180
副流感病毒Ⅰ型PCR檢測(cè)試劑盒    11-1901
副流感病毒Ⅱ型PCR檢測(cè)試劑盒    11-1200