豬流行性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,，PED)是由豬流行性腹瀉病
毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病,，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害極大,，
所以及早確診對(duì)該病的防治具有特別重要的意義。豬流行性腹瀉病毒的傳統(tǒng)診
斷方法主要有病毒的分離鑒定,、免疫熒光抗體試驗(yàn),、免疫電鏡觀察和 ELISA
等方法。但這些方法操作過程繁瑣,、操作難度大,，所需要時(shí)間較長，專一性不
強(qiáng)因此建立一種快速,、高靈敏度的診斷方法對(duì)防治 PEDV 感染是十分必要的,。
豬流行性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒就是針對(duì)這一需求開發(fā)的實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 產(chǎn)品，它具有下列特點(diǎn)：
1. 靈敏度高,，分析靈敏度可以達(dá)到 50 拷貝/uL,，遠(yuǎn)高于常規(guī)方法,，也比常
規(guī)的 RT-PCR 檢測高 100 倍。
2. 特異性高,，根據(jù) PEDV 的 ORF3 基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,，不會(huì)誤檢其他豬
的病原性病毒（如豬輪狀病毒、豬圓環(huán)病毒,、豬傳染性胃腸炎,、豬繁殖與
呼吸綜合癥病毒、豬偽狂犬病病毒,、豬細(xì)小病毒和豬瘟病毒等）,。
3. 一管封閉式，避免了 RT-PCR 產(chǎn)物對(duì)后續(xù) RT-PCR 的污染,。
4. 線性范圍廣,，在 10-107拷貝/uL 的靶分子濃度范圍內(nèi)均呈線性。
5. 簡單快捷,，只需要 2 小時(shí)即可得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
規(guī)格及成分 成 份 50 次塑料袋包裝
即用型熒光 RT-PCR Mix 750 uL
PEDV 專一性引物對(duì) 100 uL
PEDV 陽性對(duì)照（XXX 拷貝/uL） 50 uL
超純水 1 mL
使用手冊 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存,，有效期一年,。
自備試劑 樣品。
使用方法 一,、樣品 RNA 的制備
用自選方法純化 PEDV 樣品的 RNA,，也可以另購本公司的病毒 RNAout
或柱式病毒 RNAout，上述兩款產(chǎn)品跟本試劑盒兼容,。
二,、制備 PEDV 標(biāo)準(zhǔn)曲線
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 1,2,3,4,5 和 6 號(hào),。
2. 用帶芯分別加入 45 uL 超純水（zui用帶芯槍頭,，下同）。
3. 在 1 號(hào)管中加入 5 uL PEDV 陽性對(duì)照(本試劑盒提供),，充分震蕩 1 分鐘,。
4. 換槍頭，從 1 號(hào)管中取 5 uL 溶液到 2 號(hào)管中,，充分震蕩 1 分鐘,。
5. 換槍頭，從 2 號(hào)管中取 5 uL 溶液到 3 號(hào)管中,，重復(fù)上面的操作直到得到
6 個(gè)稀釋度的樣品,。
6. 從 6 個(gè)管中分別取 5 uL 進(jìn)行定量 RT-PCR（見下步），每個(gè)樣品zui重
復(fù) 3 次。
三,、熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)（30 uL 體系）
7. 在 PCR 管中加入下列成分（每個(gè)樣品zui重復(fù)三次,，這里只列出一次）：
成 份 樣品
6 個(gè)陽性對(duì)照（見制
備 PEDV 標(biāo)準(zhǔn)曲
線）
陰性對(duì)照
PEDV 專一性引物對(duì) 2 uL 2 uL 2 uL
樣品 RNA 5 uL 無 無
PEDV 陽性對(duì)照（XXX 拷
貝/uL）
無
5 uL（每個(gè)管加一
個(gè)稀釋度的對(duì)照） 無
自備 1×ROX (見注) 2 uL 2 uL 2 uL
補(bǔ)超純水到 15 uL 15 uL 15 uL
即用型熒光 RT-PCR Mix 15 uL 15 uL 15 uL
注：僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照,，其他熒光
PCR 儀器（如 iCycler IQ,、MJ Option、MJ Chromo4,、MX3000,、MX4000、
RotorGene 3000,、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX,。
此處陰性對(duì)照用的是水，用戶也可以用其他 RNA 做陰性對(duì)照,。
8. 輕柔混勻后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行定量 RT-PCR，反應(yīng)參數(shù)如下：
過程 溫度 時(shí)間 其他
RT（逆轉(zhuǎn)錄） 42℃ 5 分鐘
預(yù)變性 95℃ 2 分鐘
PCR 反應(yīng)
（40 個(gè)循環(huán)）
94℃ 15 s
62℃ 25 s
收集熒光數(shù)據(jù),，所
選擇波長見注,。
溶解曲線分析判斷產(chǎn)
物特異性
加熱到 95℃ 10 分鐘，然后降低到 55℃后,，
按 0.5℃/10s 的升幅將溫度提高到 95℃，
其間記錄下熒光信號(hào)的變化,。特異的 PEDV
PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物將在 82.2℃產(chǎn)生特異峰,。
注：本產(chǎn)品所用熒光染料跟 RNA 結(jié)合時(shí)的zui大光吸收是 500 nm，zui大發(fā)射
波長是 530 nm,，不同 PCR 產(chǎn)物（DNA 段）結(jié)合時(shí)zui大吸收波長是 471 nm,，
無發(fā)射。
四,、數(shù)據(jù)處理
9. 以 PEDV 陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。
再用濃度的的 log 為橫軸,，以 Ct 值為縱軸，通過待測樣品的 Ct 值反推出
樣品 RNA 的濃度,。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 豬傳染性胃腸炎病毒 RT-PCR 試劑盒（CAT#：11-210）