Seamless Cloning Kit（無(wú)縫克隆試劑盒）是一種新型的基于插入片段和線性化載體的末端進(jìn)行同源重組的基因克隆試劑盒。本試劑盒利用包含了DNA 5' 外切酶（5' Exonuclease）,、DNA聚合酶（DNA Polymerase）和DNA連接酶（DNA
Ligase）活性的重組酶（assembly enzyme）,，通過(guò)同源重組的方法可以將一個(gè)或多個(gè)DNA片段按照預(yù)定方向、快速,、高效

 上海雅吉生物的Seamless Cloning Kit(無(wú)縫克隆試劑盒)是一種新型的基于插入片段和線性化載體的末端進(jìn)行同源重組的基因克隆試劑盒,。本試劑盒利用包含了DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA連接酶(DNA
Ligase)活性的重組酶(assembly enzyme),，通過(guò)同源重組的方法可以將一個(gè)或多個(gè)DNA片段按照預(yù)定方向,、快速、高效和精確
地插入到線性化載體中,，并且zui終構(gòu)建的克隆沒(méi)有任何額外的堿基序列,，因此被稱作“無(wú)縫克隆”,。
      和傳統(tǒng)的基因克隆方法相比,，本試劑盒的無(wú)縫克隆方法有多方面的突出優(yōu)點(diǎn)：(1) zui終構(gòu)建的克隆沒(méi)有任何額外的堿基序列,，因此是真正的"無(wú)縫克隆"；(2) 可通過(guò)一個(gè)反應(yīng)將一個(gè)或多個(gè)片段快速,、定向地插入到載體的任何位置；(3) 待插入的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)須酶切,；(4) 插入片段的大小范圍寬，從20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入,；(5) 可通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得線性化載體,，因此限制性內(nèi)切酶消化并不是克隆所必須的,；(6) 酶催化的重組連接反應(yīng)非?？焖俸透咝В瑢?duì)于一個(gè)片段的插入僅需50℃處理15分鐘,；對(duì)于三個(gè)片段的插入僅需50℃處理30分鐘,，而對(duì)于5個(gè)片段的插入也僅需50℃處理約60分鐘,；(7) 只有插入片段和線性化載體的末端才能發(fā)生同源重組，可以有效避免非特異性的同源重組,；(8) 陽(yáng)性克隆比例高，單個(gè)DNA片段克隆的陽(yáng)性率幾乎為100%,，三個(gè)片段的克隆陽(yáng)性率約為70-80%,。
      本無(wú)縫克隆試劑盒操作非常簡(jiǎn)單,。本試劑盒進(jìn)行基因克隆時(shí)沒(méi)有酶切位點(diǎn)的限制,，僅需在載體的預(yù)定克隆位點(diǎn)通過(guò)酶切進(jìn)行線性化或通過(guò)PCR的方法直接制備線性化的載體，在插入片段的兩個(gè)PCR引物的5' 端引入與載體克隆位點(diǎn)兩端**的
15~25bp的重疊序列,。重組反應(yīng)可以在50℃快速進(jìn)行，3-4小時(shí)內(nèi)即可完成從DNA樣品的PCR擴(kuò)增,、純化,、重組,、到轉(zhuǎn)化涂板的全部操作,。其中PCR反應(yīng)約2-3小時(shí)，PCR產(chǎn)物純化約20分鐘,，重組反應(yīng)15分鐘,，轉(zhuǎn)化涂板約40分鐘,，共計(jì)約3-4小時(shí)即可完成。
      無(wú)縫克隆試劑盒的工作原理示意圖請(qǐng)參考圖1,。

 圖1. 無(wú)縫克隆試劑盒的工作原理圖,。重疊區(qū)域(overlap region)的DNA序列**,，通常長(zhǎng)度為15-25bp。不同顏
色的重疊區(qū)域代表不同的重疊序列,。在插入2個(gè)或以上片段時(shí),，不同的重疊序列可以確保待插入片段有序地插入到線性化的載體(linearized vector)中,。
      Seamless Cloning Kit(無(wú)縫克隆試劑盒)用于一個(gè)1100bp片段的克隆和三個(gè)不同的1100bp片段的克隆,，其重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂板獲得的LB平板的實(shí)測(cè)效果參考圖2A,，菌落PCR鑒定結(jié)果參考圖2B,。

 

圖2. 本試劑盒用于無(wú)縫克隆的實(shí)測(cè)效果,。A. 本試劑盒反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α后涂板獲得的LB平板效果圖。在20μl反應(yīng)體系中,，將雙酶切線性化的載體pUC18 (Linearized pUC18),，與通過(guò)PCR擴(kuò)增的含有重疊序列的插入片段(DNA fragment, 1100bp)混合(pUC18載體與PCR片段的摩爾比為1:3)；或者與3個(gè)有適當(dāng)重疊序列的不同的1100bp片段混合,，pUC18載體與PCR片段的摩爾比為1:1:1:1,，然后加入10μl的2X Seamless Cloning Mix,，并用水補(bǔ)至20μl，50℃反應(yīng)15min(插入一個(gè)片段)或
30min(插入三個(gè)片段),。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物放置在冰上5min,，取5μl轉(zhuǎn)化到100μl的DH5α感受態(tài)細(xì)菌中。對(duì)照組中只加入線性化的載體pUC18,，同時(shí)也在50℃反應(yīng)15min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，插入片段數(shù)目越多轉(zhuǎn)化后得到的克隆數(shù)越少,。B.菌落PCR鑒定用本試劑盒構(gòu)建得到的克隆,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，插入1個(gè)片段時(shí)的陽(yáng)性率基本上為100%,，插入3個(gè)片段時(shí)的陽(yáng)性率約為70%左右,。
包裝清單：

產(chǎn)品編號(hào)    產(chǎn)品名稱    包裝
D7010S-1    2X Seamless Cloning Mix    200μl
D7010S-2    Linearized pUC18 (50ng/μl)    10μl
D7010S-3    DNA fragment (1100bp, 60ng/μl)    10μl
D7010S-4    Nuclease free water    200μl
—    說(shuō)明書    1份
保存條件：
      -20℃保存,，一年有效,。
Seamless Cloning Kit(無(wú)縫克隆試劑盒)注意事項(xiàng)：
      單個(gè)片段的PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)，如果PCR條帶單一,，可以無(wú)須純化并直接進(jìn)行重組反應(yīng),，但PCR產(chǎn)物的體積不得超過(guò)重組反應(yīng)體系的20%，并且重組效率通常會(huì)低于純化后的PCR產(chǎn)物,。
      對(duì)于多個(gè)片段的重組反應(yīng),，重組效率通常會(huì)低于單個(gè)片段的重組效率，建議膠回收純化后再進(jìn)行重組反應(yīng),。對(duì)于3個(gè)以上片段的重組反應(yīng)或重組片段大于5kb時(shí),，強(qiáng)烈建議在膠回收后再進(jìn)行重組反應(yīng)。通常膠回收后，重組效率可提高2-10倍,。
      單片段和線性化載體重組時(shí)，摩爾比至少為2:1,。多片段和線性化載體重組時(shí),，各個(gè)片段和線性化載體的摩爾數(shù)宜保持*,。
      Seamless Cloning Kit(無(wú)縫克隆試劑盒)僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療,，不得用于食品或藥品,，不得存放于普通住宅內(nèi),。
      為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。