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概述

免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個基本流程：樣本制備,、細(xì)胞分選、分型鑒定,、擴(kuò)增&培養(yǎng),、質(zhì)量優(yōu)化、后續(xù)研究,。小愛已經(jīng)給大家詳細(xì)介紹了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之樣本制備（一）》,、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之細(xì)胞分選（二）》、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定（三）》,、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之擴(kuò)增&培養(yǎng)（四）》,、《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之質(zhì)量優(yōu)化（五）》今天我們繼續(xù)來了解一下后續(xù)研究。

后續(xù)研究（Follow-Up Study）：運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù),、ELISA,、細(xì)胞共培養(yǎng)等實驗技術(shù)研究免疫細(xì)胞的功能（殺傷能力、分泌細(xì)胞因子,、吞噬功能,、增殖能力等）。免疫細(xì)胞可以做的后續(xù)研究實在是太多了,，比如：CAR-T/NK/M,，腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)、類器官免疫共培養(yǎng),，細(xì)胞因子風(fēng)暴等等,，小愛在這里拋磚引玉，給大家介紹3個免疫細(xì)胞研究的熱門思路：NK細(xì)胞殺傷能力鑒定,、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),、Treg體外抑制實驗,。

NK細(xì)胞殺傷能力鑒定

NK作為自帶免疫記憶的自然殺傷細(xì)胞，對其殺傷功能的研究也是十分火熱,。

NK細(xì)胞主要通過以下四個途徑殺傷靶細(xì)胞：

①NK細(xì)胞脫顆粒,，釋放穿孔素和顆粒酶殺傷靶細(xì)胞；

②活化的NK細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子來殺傷靶細(xì)胞,；

③通過死亡受體如Fas/FasL和TNF-α/TNFR-1途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡,；

④介導(dǎo)ADCC作用殺傷靶細(xì)胞[1]。

圖1 NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的四種途徑

體外研究NK細(xì)胞殺傷功能主要是將NK細(xì)胞與靶細(xì)胞（通常是K562細(xì)胞）共培養(yǎng),，然后通過檢測靶細(xì)胞釋放的酶或者用CAM,、CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞，通過檢測熒光,，也可以通過MTT/CCK8檢測細(xì)胞數(shù)量,，從而得出NK細(xì)胞的殺傷活性，也可以檢測NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或者脫顆粒指標(biāo)CD107a,。當(dāng)然我們可以換成其他的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),。

小愛也給大家整理了步驟可以參考：

1、將用熒光染料GFP,，CFSE標(biāo)記的靶細(xì)胞（一般為腫瘤細(xì)胞）接種到96孔板中,，不同腫瘤細(xì)胞的接種密度可以參考圖2；

圖2 用于NK和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)中不同腫瘤細(xì)胞的接種密度

2,、第二天,，將培養(yǎng)基更換成NK細(xì)胞的培養(yǎng)體系，并按照靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞(NK)1:3的比例加入NK細(xì)胞,，0-12h分別進(jìn)行熒光顯微鏡拍照,；

注意：靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的共培養(yǎng)比例以及時間均需要通過預(yù)實驗確定。

圖3 不同上皮細(xì)胞系在與NK共培養(yǎng)中的累積存活曲線

表1 腫瘤免疫共培養(yǎng)表格

混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）

混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（Mixed Lymphocyte Reaction, MLR）也稱作混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),，是指在抗原提呈細(xì)胞刺激下,，T細(xì)胞發(fā)生增殖和活化，根據(jù)淋巴細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)度來評價組織相容性抗原差異和對異體細(xì)胞的反應(yīng)能力,?？梢苑譃?strong>雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)、單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),。體外研究中,，通常也會檢測T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ、T細(xì)胞增殖抗原CD107a,。

雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：將來自兩個不同供體的 PBMC 共培養(yǎng),，使來自兩個供體的T細(xì)胞發(fā)生雙向活化。

單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：將從一個供體分離的 CD4+T細(xì)胞與從另一個供體分離的DC相結(jié)合,，從而使 T 細(xì)胞發(fā)生單向活化,。

圖4 單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體外研究示意圖

小愛以單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)為例給大家介紹實驗步驟：

1,、用50μg/mL的絲lie霉素37℃處理來自供體B的PBMCs 30min，這些細(xì)胞作為刺激細(xì)胞,；

2,、300×g離心5min，去除絲lie霉素,，按照2x10⁶個PBMCs/mL（或者磁珠分選出DC細(xì)胞）接種到24孔板(250uL)中,；

3、再加入250uL來自供A的個PBMCs(2x10⁶cells/mL)（或者磁珠分選出T細(xì)胞）,，作為應(yīng)答細(xì)胞,；

4、將刺激細(xì)胞和應(yīng)答細(xì)胞構(gòu)成的MLR置于37℃,，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)七天,；

5、7天后可以檢測應(yīng)答細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌情況,。

表2 腫瘤免疫共培養(yǎng)表格

CD4+CD25+Treg和CD8+T體外抑制實驗

體外抑制實驗的優(yōu)勢在于,，因為只有Tresp細(xì)胞（CD4+CD25-）或Treg細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，所以可以直接評估Treg細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用,。除CD8+T細(xì)胞外,，也可以通過改變實驗條件來評估Treg細(xì)胞對其它免疫細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞)的影響。

小愛也給大家整理了文獻(xiàn)中的實驗步驟,，可以作為參考：

1、CD3/CD28磁珠的清洗：

1）在離心管里重懸磁珠（渦旋超過30s,，或者顛倒混勻5min）,；

2）將確定體積的磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中；

3）加入等體積的PBS緩沖液含1%的HSA,，或者至少1ml的體積,，進(jìn)行重懸；

4）把離心管放在磁力架（磁珠專用）上1min,，隨后棄去上清,；

5）將離心管從磁力架（磁珠專用）上轉(zhuǎn)移下來，用相同體積的PBS緩沖液含1%的HSA重懸磁珠（第二步最初體積的磁珠）,。

2,、取50μL CD4+CD25+Treg細(xì)胞（1×10⁵cells/孔）。每孔加50μL CD8+T細(xì)胞作為應(yīng)答T (Tresp)細(xì)胞（1×10⁵cells/孔）,。每孔加入已經(jīng)洗過的CD3/CD28磁珠,，磁珠和細(xì)胞的比例調(diào)整為1:1 。

注意：在此步驟中,，標(biāo)記和建立對照孔如下：未刺激CD8+T（不含anti-CD3/CD28）,；刺激的CD8+T細(xì)胞（含anti-CD3/CD28）,；刺激的Treg細(xì)胞（含anti-CD3/CD28）。Treg細(xì)胞可以用wan全培養(yǎng)基稀釋,，以不同比例的Tresp細(xì)胞與Treg細(xì)胞（1:0.25-1:1）共培養(yǎng),；

3、各孔加50μL或適當(dāng)體積的培養(yǎng)基,，總體積為200μL,。用鋁箔蓋住板子，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)72h,；

4,、培養(yǎng)72h后進(jìn)行細(xì)胞因子產(chǎn)生分析，將每孔上清液分離到另一個板上,，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),，檢測IFN-γ水平；

5,、將每孔上清液分離后,，用FACS緩沖液清洗含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿，4°C,，300g離心2min,，洗3次；

6,、洗滌后,，棄去上清。用50μL的抗體緩沖液（anti-CD4,、anti-CD8和細(xì)胞活力檢測試劑）重懸細(xì)胞,，對增殖的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行染色（在獲得CD8+T細(xì)胞時，可使用追蹤細(xì)胞增殖的染料進(jìn)行標(biāo)記）,。4°C避光孵育20min,；

7、4°C,，300g離心2min,，洗兩次。洗滌后,，棄上清,，用100μL固定緩沖液4℃避光固定20min；

8,、4°C,，300g離心2min，洗兩次,。200μL FACS緩沖液重懸細(xì)胞,，流式細(xì)胞術(shù)檢測標(biāo)記CD8+T細(xì)胞增殖情況,。

圖6 活化的Treg細(xì)胞抑制CD8+T細(xì)胞的增殖以及分泌IFN-γ

今天講解就到這了，大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問題,，歡迎一起交流哦,！

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