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免疫細(xì)胞(immune cells)是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞,、樹突狀細(xì)胞,、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞,、肥大細(xì)胞等,，其在免疫細(xì)胞療法中扮演著至關(guān)重要的角色。免疫細(xì)胞療法,，即通過(guò)采集身體中的免疫細(xì)胞,，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，擴(kuò)增,，最后回輸?shù)襟w內(nèi),，來(lái)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗能力。因此免疫細(xì)胞培養(yǎng)至關(guān)重要,。

為此,，小愛創(chuàng)建了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略合集》，將為大家詳細(xì)地介紹免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程：樣本制備,、細(xì)胞分選,、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng),、質(zhì)量?jī)?yōu)化,、后續(xù)研究。今天我們先一起學(xué)習(xí)樣本制備,！

圖1 免疫細(xì)胞分化歷程及相關(guān)細(xì)胞因子（圖源網(wǎng)絡(luò)）

除此之外,，我們也要了解免疫細(xì)胞在血液以及各免疫器官中的分布及比例，如此,，我們才能選擇目的免疫細(xì)胞相對(duì)富集的樣本進(jìn)行單細(xì)胞懸液的制備,。以下列舉了人外周血，小鼠脾臟,、外周血和淋巴結(jié)中免疫細(xì)胞的比例，供大家參考（表1和表2）,。

表1 人外周血免疫細(xì)胞的比例

表2 小鼠脾臟,、外周血,、淋巴結(jié)免疫細(xì)胞的比例

實(shí)驗(yàn)步驟

一、樣本制備預(yù)處理

在正式的樣本制備之前,，我們還需進(jìn)行樣本采集和預(yù)處理,。根據(jù)目的免疫細(xì)胞的分化以及血液和免疫器官分布，選擇合適的樣本,，新鮮取材,，并進(jìn)行相關(guān)的預(yù)處理。

血液：從血液中制備PBMC是分離特定免疫細(xì)胞亞群的一個(gè)常見方法,。采集血液樣品后,，要裝入含適當(dāng)抗凝劑的容器中防止凝集，并且血液要與抗凝劑充分輕柔混勻,。不同的抗凝劑其抗凝原理略有不同,，小愛也為大家整理了常見抗凝劑的原理及優(yōu)缺點(diǎn)（表3）。目前來(lái)說(shuō),，適合后續(xù)免疫細(xì)胞培養(yǎng)的抗凝劑是肝素抗凝劑,。

表3 常用抗凝劑匯總

實(shí)體組織：實(shí)體組織的預(yù)處理相對(duì)簡(jiǎn)單，主要是組織的清洗,。使用培養(yǎng)基或PBS等清洗組織上殘留的血液,，并剔除相關(guān)的結(jié)締組織，整合過(guò)程中也一定要保證無(wú)菌,。

注意事項(xiàng)：

1）樣本的取材一定要新鮮無(wú)菌,，這樣才能保證細(xì)胞的狀態(tài)；

2）血液要與抗凝劑輕柔混勻,，劇烈晃動(dòng)可導(dǎo)致溶血,；

3）血液采集后，需進(jìn)行檢測(cè)以保證質(zhì)量及無(wú)菌,。

二,、樣本制備

樣本制備(Sample Preparation)：免疫細(xì)胞的來(lái)源可分為血液和各種實(shí)體組織，由此,，樣本制備的方法則分為PBMC的制備和實(shí)體組織制備成單細(xì)胞懸液,。

1、單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的制備方法主要是密度梯度離心,，其原理為血液中各細(xì)胞成分的比重存在差異,，利用比重為1.077、近于等滲的人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)作密度梯度離心時(shí),，各成分將按密度梯度聚集,。

具體步驟如下：

1）準(zhǔn)備無(wú)菌的15mL離心管或錐形管； 

2）加入人淋巴細(xì)胞分離液(abs930)5mL,。（注意：淋巴細(xì)胞分離液使用前需恢復(fù)室溫,，18-25℃）,；

3）Hank‘s液(abs9257)或PBS(abs962)緩沖液1:1比例（如果全血樣本粘稠，可適當(dāng)增大比例）稀釋抗凝過(guò)的全血樣品,；

4）小心沿著壁管,，接近分離液層面，非常緩慢地加入新鮮的稀釋過(guò)的4mL全血樣品在淋巴細(xì)胞分離液上面（注意：切記不要攪渾淋巴細(xì)胞分離液）,；

5）小心放進(jìn)離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子）,，4℃離心25min，速度為500g,，在此過(guò)程中升降速度降至1,，避免產(chǎn)生細(xì)胞融合；

6）小心取出離心管（切記不要震動(dòng)）,，棄掉上層黃色的液體,，吸取中間層的白色薄膜層，即為PMBC（如圖2）,；

圖2 抗凝血中加入Ficoll后圖示（左）,；離心分層后圖示（右圖）

7）用10mL PBS洗滌獲得的PBMC，離心10min,，轉(zhuǎn)速250g,，在此過(guò)程中升降速度降至1，避免產(chǎn)生細(xì)胞融合,，棄上清,；

8）重復(fù)洗滌一次并重懸細(xì)胞備用。

注意事項(xiàng)：

1）人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)和血液（現(xiàn)取現(xiàn)用）在實(shí)驗(yàn)前恢復(fù)至室溫（18-25℃為宜）并顛倒混勻,，防止淋巴細(xì)胞分離液低溫時(shí)密度增加和紅細(xì)胞低溫時(shí)聚集,，以減少PBMC被紅細(xì)胞污染；

2）為保持淋巴細(xì)胞的活性,，血液最好選取采血2h以內(nèi)的新鮮抗凝血液,；如需對(duì)分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)和檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)诓裳头蛛x過(guò)程中注意無(wú)菌操作,；

3）稀釋或洗滌緩沖液,，不可使用含鈣、鎂離子的緩沖液,，以免導(dǎo)致血細(xì)胞凝聚,；

4）離心傾倒收獲細(xì)胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層,，有助于減少細(xì)胞被血小板污染,；

5）過(guò)多吸取淋巴細(xì)胞白膜層以外的成分，會(huì)導(dǎo)致交界處的一些粒細(xì)胞或血小板等被混入；

6）由于不同血液樣本間的差異,，可能對(duì)分離效果產(chǎn)生影響,。可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整離心力和時(shí)間,，參考離心力和時(shí)間范圍為：400-1000g、20-30min,；

7）將血液和淋巴細(xì)胞分離液混合一定時(shí)間后,，出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降屬于正常現(xiàn)象,。

2,、實(shí)體組織制備成單細(xì)胞懸液：傳統(tǒng)的實(shí)體組織解離成單細(xì)胞懸液的方法有機(jī)械法、酶解法和化學(xué)法,。小愛也為大家整理了這三種方法的原理,、適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)（表4）。

表4 組織制備單細(xì)胞懸液傳統(tǒng)方法的區(qū)別

聯(lián)合使用機(jī)械法和酶解法獲得單細(xì)胞懸液是很常用的方法,，步驟如下：

所需試劑,、耗材、器械與儀器：

試劑：DMEM培養(yǎng)基(abs9483),，紅細(xì)胞裂解液(abs9101)

耗材：1.5mL離心管(abs7119),，15mL離心管(abs7120)，50mL離心管(abs7121),，一次性無(wú)菌過(guò)濾器(70µm)(abs7306)

器械: 眼科剪,、眼科鑷

儀器：恒溫?fù)u床，離心機(jī)

操作步驟：

1）取新鮮組織100mg左右加至無(wú)菌離心管中,，用眼科剪將組織剪碎至1-2mm³ ,，加入組織解離液(abs9482)1mL；

2）將離心管置于恒溫?fù)u床上,，37℃/180rpm震蕩孵育60min消化組織,，可根據(jù)組織的不同適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間；

3）孵育結(jié)束后將離心管內(nèi)的組織勻漿用70µm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾,，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗無(wú)菌過(guò)濾器,，用50mL的離心管收集濾液；

4）將細(xì)胞懸液1200rpm離心5min,，棄上清,；

5）再加入適量培養(yǎng)基，1200rpm離心5min,，棄上清,；

6）用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取少量細(xì)胞鏡下觀察消化情況；

7）根據(jù)需要將細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),；

8）（可選）可使用紅細(xì)胞裂解液去除組織解離過(guò)程中的紅細(xì)胞,。

注意事項(xiàng)：

1）組織解離液可根據(jù)實(shí)際使用量進(jìn)行分裝，置于-20℃保存,，隨用隨取,，避免反復(fù)凍融；

2）組織解離液2-8℃保存應(yīng)不超過(guò)48h,，2-8℃長(zhǎng)時(shí)間保存會(huì)降低產(chǎn)品的解離效果,；

3）若組織解離獲取的細(xì)胞用于細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)保證所有操作均在無(wú)菌條件下完成,。 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

適用于多種組織的解離,，解離后細(xì)胞活率高。

abs9482將小鼠心臟組織處理為單細(xì)胞懸液后做流式：細(xì)胞活力,、CD45,、CD3、CD4,、CD8染色結(jié)果

abs9482將小鼠肝臟處理為單細(xì)胞懸液后做流式：細(xì)胞活力,、CD45、CD3,、CD4,、CD8染色結(jié)果

abs9482將小鼠腸道組織處理為單細(xì)胞懸液后做流式：細(xì)胞活力、CD45,、CD3,、CD4、CD8染色結(jié)果

abs9482將小鼠脾臟處理為單細(xì)胞懸液后做流式：細(xì)胞活力,、CD45,、CD3、CD4,、CD8染色結(jié)果

abs9482將小鼠腫瘤組織處理為單細(xì)胞懸液后做流式：細(xì)胞活力,、CD45、CD3,、CD4,、CD8染色結(jié)果

今天講解就到這了，下一期我們講解細(xì)胞分選,，大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題,，歡迎后臺(tái)交流哦！

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