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1,、什么是內(nèi)參？

內(nèi)參是Western Blot實(shí)驗中用于標(biāo)準(zhǔn)化和校正實(shí)驗誤差的一類蛋白質(zhì),。它們通常是在不同組織和細(xì)胞中表達(dá)相對恒定的蛋白質(zhì),，由管家基因編碼，常用作檢測目的蛋白表達(dá)水平變化時的參照物,。

2,、內(nèi)參在WB中的作用是什么？

校正實(shí)驗誤差：內(nèi)參用于校正蛋白質(zhì)定量和上樣過程中的實(shí)驗誤差,，以保證實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,。由于不同的樣品在蛋白質(zhì)提取、定量,、上樣等步驟中可能存在操作誤差,，使用內(nèi)參可以對這些誤差進(jìn)行校正。

半定量分析：通過比較內(nèi)參和目標(biāo)蛋白的信號強(qiáng)度,，可以對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行半定量分析。如果樣品蛋白量有限,，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗時,，分別檢測樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量,，然后將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量,，用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析,。

作為空白對照：內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否wan全,，以及整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常,。

確保實(shí)驗結(jié)果的可比性：在比較不同條件下或不同組織中目的蛋白表達(dá)量的相對多少時，內(nèi)參提供了一個參照標(biāo)準(zhǔn),，確保了實(shí)驗結(jié)果的可比性,。

3、常見的WB內(nèi)參有哪些,？

β-Actin：β-肌動蛋白是一種細(xì)胞骨架蛋白,，分子量42KDa左右，廣泛分布于各種組織中,，表達(dá)量豐富且相對恒定,。它通常用作總蛋白的內(nèi)參，尤其是在非肌肉組織中,。然而,，需要注意的是，β-Actin在某些特定組織（如心?。┲械谋磉_(dá)量可能較低,，因此并非在所有情況下都適用。此外,，不同的β-Actin亞型在不同組織中的分布也有所不同,，選擇抗體時需考慮這一點(diǎn)。

大鼠腦裂解物20μg 

人結(jié)腸癌組織

Hela細(xì)胞 

abs171598 Rabbit anti-β-Actin Monoclonal Antibody

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）：36kD左右,，GAPDH是一種廣泛表達(dá)的蛋白，適用于多種細(xì)胞類型,。然而,，在某些條件下，如缺氧或糖尿病,，GAPDH的表達(dá)可能會受到影響，因此需要根據(jù)實(shí)驗條件謹(jǐn)慎選擇,。

1: HeLa whole cell lysate 20ug Lane

2: THP-1 whole cell lysate 20ug Lane

 3: MCF7 whole cell lysate 20ug Lane

4: NIH/3T3 whole cell lysate 20ug Lane

5: mouse spleen lysate 20ug Lane

 6: C6 whole cell lysate 20ug Lane

7: rat spleen lysate 20ug 

abs132004 Rabbit anti-GAPDH Polyclonal Antibody

β-Tubulin：55kDa左右，β-Tubulin是微管蛋白的一種,，參與構(gòu)成細(xì)胞骨架。由于其在細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá),，尤其用于檢測細(xì)胞骨架蛋白時。β-Tubulin的表達(dá)在多種細(xì)胞類型中相對恒定,，但同樣需要考慮特定條件下的表達(dá)變化,，如在凋亡細(xì)胞中。

Hela細(xì)胞全裂解物

大鼠腎組織

NIH3T3細(xì)胞

abs171597 Rabbit anti-β-Tubulin Monoclonal Antibody

除了以上介紹的內(nèi)參以外,，還有α-Tubulin,、Hsp90等等，每個內(nèi)參的分子量及適用情況不一樣,，建議選擇之前做好功課,。

4、如何挑選合適的內(nèi)參,，需要考慮哪些因素,？

目的蛋白分子量：內(nèi)參蛋白的分子量應(yīng)與目標(biāo)蛋白的分子量相差至少5kDa以上，以確保在凝膠電泳和Western Blot中能夠清晰地區(qū)分目標(biāo)蛋白和內(nèi)參的條帶,。

樣本種屬來源：不同種屬的樣本可能需要選擇不同的內(nèi)參蛋白,。例如，哺乳動物的組織或細(xì)胞樣本常選擇β-actin,、β-tubulin,、GAPDH等，而植物樣本可能選擇plant actin,、Rubisco等作為內(nèi)參,。

細(xì)胞定位：根據(jù)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位選擇相應(yīng)的內(nèi)參,。例如，如果是檢測全細(xì)胞或細(xì)胞質(zhì)蛋白,，可以選擇β-actin,、β-tubulin、GAPDH等,；如果是核蛋白,，則可能選擇Lamin B、Histone H3等作為內(nèi)參,。

實(shí)驗環(huán)境：內(nèi)參的選擇還需要考慮實(shí)際的實(shí)驗環(huán)境和樣品的前處理,。在某些特殊條件下，一些內(nèi)參蛋白的表達(dá)可能會發(fā)生變化，從而影響其作為內(nèi)參的穩(wěn)定性和可靠性,。例如,，在缺氧或糖尿病等條件下，GAPDH的表達(dá)可能會增加,，因此可能不適合作為內(nèi)參,。

組織特異性：不同的組織可能需要選擇不同的內(nèi)參。例如,，肌肉組織中可能需要選擇特定的肌動蛋白亞型作為內(nèi)參,，而在非肌肉組織中則可能選擇β-actin等。

5,、內(nèi)參抗體和目標(biāo)抗體如何孵育,？

順序孵育：在檢測完目標(biāo)蛋白后，使用strip緩沖液洗掉膜上的抗體,，然后重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育和顯色檢測,。這種方法需要在兩次孵育過程中使用同一張膜。

雙膜法：在蛋白轉(zhuǎn)膜后,，根據(jù)預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪成大分子量和小分子量兩部分,，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行孵育和顯色,。

同時孵育（如果分子量相差較大）：如果目的蛋白的分子量與內(nèi)參蛋白的分子量相差較大,，可以在轉(zhuǎn)膜后的同一張膜上同時進(jìn)行兩種抗體的孵育。由于條帶位置的差異,，可以在同一張膜上分別檢測內(nèi)參和目標(biāo)蛋白,。

使用標(biāo)記內(nèi)參抗體：有些實(shí)驗室使用預(yù)先標(biāo)記有酶（如HRP）的內(nèi)參抗體，這樣可以在二抗孵育時加入這種標(biāo)記內(nèi)參抗體,，按照正常操作進(jìn)行顯色,。

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