聯(lián)系電話
參考價: | 面議 |
- 40306ES20 產(chǎn)品型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù):6728更新時間:2022-11-07 15:23:21
- 聯(lián)系人:
- 曹女士
- 電話:
- 400-6111-883
- 手機:
- 售后:
- 4006-111-883
- 傳真:
- 86-21-34615995
- 地址:
- 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號3樓
- 網(wǎng)址:
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機商鋪
供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 20T |
---|---|---|---|
貨號 | 40306ES20 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
主要用途 | 細胞凋亡檢測試劑盒 |
TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)
TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC)
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 儲存 | 價格元 |
TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC) | 40306ES20 | 20T | -20oC | 988.00 |
TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC) | 40306ES50 | 50T | -20oC | 1988.00 |
TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC) | 40306ES60 | 100T | -20oC | 3198.00 |
產(chǎn)品描述
細胞在發(fā)生凋亡時,會激活一些DNA內(nèi)切酶,,這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA,。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測,可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder,。
TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)細胞凋亡檢測試劑盒(FITC)可以用來檢測組織細胞在凋亡晚期過程中細胞核DNA的斷裂情況,。其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的作用下,在基因組DNA斷裂時暴露出的3′-羥基(3′-OH)末端摻入FITC-12-dUTP,,從而可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測,。
本試劑盒對標記反應(yīng)進行了優(yōu)化,,采用*比例的FITC-12-dUTP和未標記dNTP進行3’-OH末端的核苷酸摻入,使得同一個斷裂的DNA片段末端可以形成更長的“標記尾巴",。該“標記尾巴"減少了相鄰摻入dNTP上標記基團的空間位阻,,增加每個斷裂片段上的熒光基團數(shù)目,降低熒光基團相鄰后可能造成的聚集和淬滅,,從而提高檢測靈敏度,,減少非特異性反應(yīng)。
本試劑盒應(yīng)用范圍廣,,可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況,,也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。
產(chǎn)品組分
編號 | 組分 | 產(chǎn)品編號/規(guī)格 | ||
40306ES20(20T) | 40306ES50(50T) | 40306ES60(100T) | ||
40306-A | 5×Equilibration Buffer | 750μl | 1.25 ml×2 | 1.25 ml×3 |
40306-B | FITC-12-dUTP Labeling Mix | 100 μl | 250 μl | 250 μl×2 |
40306-C | Recombinant TdT Enzyme | 20 μl | 50 μl | 50 μl×2 |
40306-D | Proteinase K (2 mg/ml) | 40 μl | 100 μl | 100 μl×2 |
40306-E | DNase I (1 U/μl) | 5μl | 12.5μl | 25μl |
40306-F | 10 × DNase I Buffer | 100 μl | 250μl | 500μl |
運輸與保存方法
冰袋(wet ice)運輸,。
本試劑盒儲存在-20℃,,F(xiàn)ITC-12-dUTP Labling Mix避光儲存于-20℃,保質(zhì)期為一年,。
注意事項
1)需自備用于洗滌細胞的PBS,,用于封片的抗熒光淬滅封片液,用于固定的4%多聚甲醛,。
2)為了您的安全和健康,,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
操作步驟
一,、樣品準備
A. 石蠟包埋組織切片
1)室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5min,,重復一次,以*脫掉石蠟,。
2)室溫下用100%乙醇浸泡切片5min,,重復一次。
3)室溫下用梯度乙醇(90,、80,、70%)各浸洗1次,每次3min,。
4)用PBS輕輕潤洗切片,,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時,,可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,,便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中,,切勿讓樣品干燥,,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。
5) 配制Proteinase K工作液:按1:100的比例,用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,,使其終濃度為20μg/ml,。
6)每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液,使其被全部覆蓋,,室溫孵育20min,。
【注】:Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險,,過短則可能造成透性處理不充分,,影響標記效率。未得到更好的結(jié)果,,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間,。
7)用PBS溶液潤洗樣本,輕輕去掉多余液體,,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。
B. 組織冰凍切片
1)將玻片浸沒在4%多聚甲\醛溶液(溶于PBS)中固定,,室溫下孵育15min,。
2)輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,。
3)將玻片浸沒在PBS溶液中,,室溫孵育15min。
4)輕輕去掉多余液體,,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,。這時,,可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,,便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中,,切勿讓樣品干燥,,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。
5) 配制Proteinase K工作液:按1:100的比例,,用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,,使其終濃度為20μg/ml。
6)每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液,,使其被全部覆蓋,,室溫孵育10min。
【注】:Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險,,過短則可能造成透性處理不充分,影響標記效率,。未得到更好的結(jié)果,,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間,。
7)用PBS溶液潤洗樣本2-3次。
8)輕輕去掉多余液體,,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。
C. 細胞爬片的準備
在Lab-Tek載玻片小室(Chamber Slides)上培養(yǎng)貼壁細胞,。在凋亡誘導處理之后,,用PBS洗2遍載玻片。
D. 細胞涂片的制備
1)準備多聚賴氨酸包被的載玻片:吸取50–100 μl 0.01% (w/v)多聚賴氨酸水溶液,,滴至每一片預清洗過的玻璃載玻片的表面,。在將要用于固定細胞的區(qū)域?qū)⒍嗑圪嚢彼崛芤和可橐槐印4d玻片晾干之后,,迅速用去離子水漂洗,,然后讓包被后的載玻片在空氣中晾干30-60 min。包被后的載玻片能在室溫儲存數(shù)月,。
2)以約2×107個細胞/ml的濃度將細胞重懸于PBS中,,吸取50-100μl細胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上,用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細胞懸液,。
3)固定細胞,,將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,在4℃放置25min,。
4)洗滌載玻片,,將其浸入PBS中,室溫放置5min,。重復用PBS洗一次,。
5)輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,。這時,,可用石蠟筆或指甲油在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,便于下游透性處理和平衡標記操作,。在實驗過程中,,切勿讓樣品干燥,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤,。
6) 配制Proteinase K工作液:按1:100的比例,,用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液,使其終濃度為20μg/ml,。
7)每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K溶液,,使其被全部覆蓋,室溫孵育5min(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中,室溫孵育5min進行通透處理),。
【注】:Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險,過短則可能造成透性處理不充分,,影響標記效率,。未得到更好的結(jié)果,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間,。
8)在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次,。
9)輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤,。
二、DNA酶處理陽性對照的步驟(可選)
在樣本通透處理后,,用DNA酶I處理細胞來準備陽性對照載玻片,。該流程通常會引起被處理的大多數(shù)細胞顯現(xiàn)綠色熒光。
【注】:DNA酶I處理固定的細胞會引起染色體DNA的斷裂,,產(chǎn)生許多可標記的DNA 3’-末端,。
1) 按1:10的比例用去離子水稀釋10×DNase I Buffer(每個樣本需用200 µl 1×DNase I Buffer,即需要用20µl 10×DNase I Buffer和180 µl去離子水混合稀釋),,取其中100 µl滴加到已通透的樣本上,,室溫孵育5min。 向剩余100μl 1×DNase I Buffer中加1μl DNase I (1U/μl),,使其終濃度為10 U/ml,。輕叩掉液體,加入100μl含5.5-10 units/ml DNase I的緩沖液,,室溫孵育10min,。
2)輕輕叩掉液體,加入100μl含10U/ml DNase I 的緩沖液,,室溫孵育10min,。
3)輕叩載玻片,去掉多余的液體,,并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中*洗3-4次。
【注】:陽性對照載玻片必須使用單獨的染色缸,,否則陽性對照載玻片上殘余的DNase I 可能會在實驗載玻片上引入高背景,。
三、標記與檢測
1)按1:5的比例用去離子水稀釋5×Equilibration Buffer,。
2)每個樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域,,室溫孵育10-30分鐘。或者將載玻片放入一個含有 1×Equilibration Buffer的缸中,,保證緩沖液沒過樣本,。在平衡細胞的同時在冰上解凍FITC-12-dUTP Labling Mix,并且依照表1,,準備足夠量的用于所有實驗的和可選陽性對照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液,。對于面積小于5cm2的一個標準反應(yīng),其體積是50μl,,用50μl乘以實驗和陽性對照反應(yīng)的數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積,。對于表面積更大的樣本,可成比例的增大試劑體積,。
表1. 準備用于實驗的和可選陽性對照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液
組分 | 體積(μl/50μl體系) |
ddH2O | 34 |
5×Equilibration Buffer | 10 |
FITC-12-dUTP Labling Mix | 5 |
Recombinant TdT Enzyme | 1 |
陰性對照體系:準備一份不含TdT酶的對照孵育緩沖液,,用ddH2O替代TdT酶。
3)在平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙洗掉100μl 1×Equilibration Buffer中的大部分,,然后在5cm2面積的細胞上加入50μl TdT孵育緩沖液,。不要讓細胞干掉。這之后的操作,,載玻片要避光,。
4)把塑料蓋玻片蓋在細胞上以保證試劑的平均分布,在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾,。將載玻片置于濕盒內(nèi),,在37℃孵育60min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光,。
【注】:塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半,。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。
5)移除塑料蓋玻片,,并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5min,。
6)輕輕去掉多余液體,換用新鮮的PBS溶液室溫孵育5 min,,重復一次,。
7) 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。注意:為了降低背景,,載玻片在用PBS洗一遍后,,可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗3次,每次5min,,這樣可將游離的未反應(yīng)標記物清除干凈,。
8) 樣本在染色缸中染色,在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液(1μg/ml,,用PBS新鮮配制并稀釋)的染色缸,,室溫放置5min,。可選操作:樣本在染色缸中染色,在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液(2μg/ml,,用PBS新鮮配制并稀釋)的染色缸,,室溫放置5min。
9)洗滌樣本,,將載玻片浸入去離子水中,,室溫放置5min,重復2次,,總共洗3次,。
10)叩干載玻片上多余的水并且用吸水紙擦拭細胞周邊的區(qū)域。
11)立即在熒光顯微鏡下分析樣本,,用標準的熒光過濾裝置在520±20nm的熒光下觀察綠色熒光,;在>620nm下觀察PI的紅色熒光,或在460nm觀察藍色的DAPI,。如有必要,,載玻片能在4℃黑暗條件下存放一個晚上。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色,,只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。
四、利用流式細胞術(shù)檢測懸浮細胞
1)將3-5×106個細胞用PBS在4℃離心(300×g)洗兩次,,然后重懸在0.5ml PBS中,。
2)固定細胞,加入5ml 1%配制于PBS中的多聚甲\醛溶液,,冰上放置20min,。
3)細胞在4℃300×g離心10min,去上清并且重懸于5ml PBS,。重復洗一次,,并用0.5 ml PBS重懸細胞。
4)通透細胞,,加入5ml冰上預冷的70%乙醇,,在-20℃孵育4小時。細胞能在70%乙醇中-20℃條件下保存一周,,或者,,細胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透,室溫放置5min,。
5)細胞在300×g離心10min,,并用5 ml PBS重懸。重復離心,,并1ml PBS重懸,。
6)轉(zhuǎn)移2×106個細胞至一個1.5ml的微量離心管。
7)300×g離心10min,,去上清,,并用80μl 1×Equilibration Buffer重懸。室溫孵育5min,。
8)在平衡細胞的同時,,在冰上融解FITC-12-dUTP標記混合物,并且依照表1,,準備足夠量的用于所有反應(yīng)的TdT孵育緩沖液,。對于2×106個細胞的一個標準反應(yīng),其體積是50μl,,用50μl乘上反應(yīng)數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積,。
9)細胞在300×g離心10min,去上清并把沉淀重懸在50μl TdT孵育緩沖液中,,37℃孵育60min,,避光。每隔15min用微量移液器輕輕重懸細胞,。
10)加入1ml 20mM EDTA終止反應(yīng),,用微量移液器輕柔混勻。
11)300×g離心10min,,去上清并把沉淀重懸在1ml配制于PBS中的0.1% Triton X-100溶液,,其中含5mg/ml BSA,重復一次,,總共洗2次,。
12)300×g離心10min,去上清并把細胞沉淀重懸在0.5ml PI溶液(5μg/ml)中,,其中包含250μg 無DNA酶的Rnase A,。
13)在黑暗中室溫孵育細胞30min。
14)用流式細胞儀分析細胞,,測量520±20nm的FITC-12-dUTP的綠色熒光和>620nm的PI紅色熒光,。PI將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色,只在凋亡細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。
實驗舉例(3T3-L cell)
陰性對照
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 價格(元) |
40306ES20 | TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC) | 20T | 1178.00 |
40306ES50 | TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC) | 50T | 2680.00 |
40306ES60 | TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC) | 100T | 4080.00 |
40307ES20 | TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488) | 20T | 1250.00 |
40307ES50 | TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488) | 50T | 3080.00 |
40307ES60 | TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488) | 100T | 4800.00 |
40308ES20 | TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 647) | 20T | 1250.00 |
40308ES50 | TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 647) | 50T | 3080.00 |
40308ES60 | TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 647) | 100T | 4800.00 |