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翌圣生物科技(上海)股份有限公司

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40307ES20TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒
參考價(jià): 面議
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)
  • 40307ES20 產(chǎn)品型號
  • Yeasen/翌圣生物 品牌
  • 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
  • 上海市 所在地

訪問次數(shù):3608更新時(shí)間:2022-11-07 15:24:05

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產(chǎn)品簡介
供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 20T
貨號 40307ES20 應(yīng)用領(lǐng)域 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè)
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí),,會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶,這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA,。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測,,可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder,。TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒可以用來檢測組織細(xì)胞在凋亡晚期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況,。
產(chǎn)品介紹

  • 產(chǎn)品信息

    產(chǎn)品名稱

    產(chǎn)品編號

    規(guī)格

    價(jià)格(元)

    *(元)

    TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)

    TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488)

    40307ES20

    20 T

    1250.00

    1188.00

    40307ES50

    50 T

    3080.00

    2926.00

    40307ES60

    100 T

    4800.00

    4320.00

    產(chǎn)品描述

    細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí),,會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶,,這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA,。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測,可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder,。

    TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488)可以用來檢測組織細(xì)胞在凋亡晚期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況,。其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的作用下,在基因組DNA斷裂時(shí)暴露出的3′-羥基(3′-OH)末端摻入Alexa Fluor 488-12-dUTP,,從而可以用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測,。

    Alexa Fluor 488染料穩(wěn)定性更高,信號更強(qiáng),,從而使標(biāo)記物更亮,,抗淬滅能力更強(qiáng)。

    本試劑盒應(yīng)用范圍廣,,可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況,,也可檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。

    產(chǎn)品組分

    組分編號

    組分名稱

    產(chǎn)品編號/規(guī)格

    40307ES20(20 T)

    40307ES50(50 T)

    40307ES60(100 T)

    40307-A

    5×Equilibration Buffer

    750 μL

    1.25 mL×2

    1.25 mL×3

    40307-B

    Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix

    100 μL

    250 μL

    250 μL×2

    40307-C

    Recombinant TdT Enzyme

    20 μL

    50 μL

    50 μL×2

    40307-D

    Proteinase K(2 mg/mL)

    40 μL

    100 μL

    100 μL×2

    40307-E

    DNase I (1 U/μL)

    L

    12.5 μL

    25 μL

    40307-F

    10 × DNase I Buffer with MgCl2

    100 μL

    250 μL

    500 μL

    運(yùn)輸與保存方法

    冰袋(wet ice)運(yùn)輸,。

    本試劑盒儲(chǔ)存在-20℃,,Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix避光儲(chǔ)存于-20℃,有效期1年,。

    注意事項(xiàng)

    1,、需自備用于洗滌細(xì)胞的PBS,,用于封片的抗熒光淬滅封片液,用于固定的4%多聚甲醛,。

    2,、為了您的安全和健康,,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

    3本產(chǎn)品僅作科研用途,!

    操作步驟

    一,、樣品準(zhǔn)備

    1.1 石蠟包埋組織切片


    1.1.1,,室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5 min,,重復(fù)一次,以*脫掉石蠟,。

    1.1.2,,室溫下用100%乙醇浸泡切片5 min,重復(fù)一次,。

    1.1.3,,室溫下用梯度乙醇(90、80,、70%)各浸洗1次,,每次3 min。

    1.1.4,,PBS輕輕潤洗切片,,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。此時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作,。在實(shí)驗(yàn)過程中切勿讓樣品干燥,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤,。

    1.1.5,,1:100的比例,用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液,,使其終濃度為20 μg/mL,。

    1.1.6每個(gè)樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液,,使其被全部覆蓋,,室溫孵育20 min。

    【注】:Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),,過短則可能造成透性處理不充分,,影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果,,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間,。

    1.1.7PBS溶液潤洗樣本2-3次,,輕輕去掉多余液體,,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本濕潤,。

    1.2,,組織冰凍切片

    1.2.1取出冰凍切片,,并回溫至室溫,。將玻片浸沒在4%多聚甲\醛溶液(溶于PBS)中固定,室溫下孵育30 min,。

    1.2.2,,輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,。

    1.2.3,,將玻片浸沒在PBS溶液中,室溫孵育15 min,,重復(fù)PBS洗一次,,共2次。

    1.2.4,,輕輕去掉多余液體,,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。此時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作,。在實(shí)驗(yàn)過程中,切勿讓樣品干燥,,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤,。

    1.2.51:100的比例,,用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液,,使其終濃度為20 μg/mL。

    1.2.6,,每個(gè)樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液,,使其被全部覆蓋,室溫孵育10 min,?!咀ⅰ浚篜roteinase K幫助組織和細(xì)胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),過短則可能造成透性處理不充分,,影響標(biāo)記效率,。未得到更好的結(jié)果,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間,。

    1.2.7,,在盛有PBS溶液的敞口燒杯中潤洗樣本2-3次。

    【注】:為了避免在清洗步驟中的樣本脫片損失,,建議不用洗瓶清洗,,而是將玻片浸在PBS溶液中2-3次進(jìn)行清洗,。

    1.2.8,,輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤,。

    1.3細(xì)胞爬片的準(zhǔn)備

    Lab-Tek載波片小室(Chamber Slides)上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞,。在凋亡誘導(dǎo)處理之后,,用PBS洗2遍載玻片。

    1.4,,細(xì)胞涂片的制備(以多聚賴氨酸包被的載玻片為例)

    1.4.1,,以約2×107個(gè)細(xì)胞/mL的濃度將細(xì)胞重懸于PBS中,吸取50-100 μL細(xì)胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上,,用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細(xì)胞懸液,。

    1.4.2固定細(xì)胞,,將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,,在4℃放置25 min。

    1.4.3,,洗滌載玻片,,將其浸入PBS中,室溫放置5 min,。重復(fù)用PBS洗一次,。

    1.4.4輕輕去掉多余液體,,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體,。這時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作,。在實(shí)驗(yàn)過程中,,切勿讓樣品干燥,,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

    1.4.5,,1:100的比例,,用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液,使其終濃度為20 μg/mL,。

    1.4.6每個(gè)樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液,,使其被全部覆蓋,室溫孵育5 min(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中,,室溫孵育5 min進(jìn)行通透處理),。【注】:Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),,過短則可能造成透性處理不充分,影響標(biāo)記效率,。未得到更好的結(jié)果,,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間。

    1.4.7,,PBS潤洗樣本2-3次,,輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中,。

    二、DNA酶處理陽性對照的步驟

    在樣本通透處理后,,用DNA酶I處理細(xì)胞來準(zhǔn)備陽性對照載玻片,。該流程通常會(huì)引起被處理的大多數(shù)細(xì)胞顯現(xiàn)綠色熒光。

    【注】DNA酶I處理固定的細(xì)胞會(huì)引起染色體DNA的斷裂,,產(chǎn)生許多可標(biāo)記的DNA 3’-末端,。

    2.1 1:10的比例用去離子水稀釋10×DNase I Buffer(每個(gè)樣本需用200 µL 1×DNase I Buffer,,即需要用20 µL 10×DNase I Buffer和180 µL去離子水混合稀釋),,取其中100 µL滴加到已通透的樣本上,室溫孵育5min,。 向剩余100 μL 1×DNase I Buffer中加1 μL DNase I (1U/μL),,使其終濃度為10 U/mL。

    2.2,,輕輕叩掉液體,,加入100 μL含10 U/mL DNase I 的緩沖液,室溫孵育10 min。

    2.3,,輕叩載玻片,,去掉多余的液體,并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中*洗3-4次,。

    【注】:陽性對照載玻片必須使用單獨(dú)的染色缸,,否則陽性對照載玻片上殘余的DNase I 可能會(huì)在實(shí)驗(yàn)載玻片上引入高背景。

    三,、標(biāo)記與檢測

    3.1,,1:5的比例用去離子水稀釋適量5×Equilibration Buffer(每個(gè)樣品需要100 μL 1×Equilibration Buffer)。

    3.2,,每個(gè)樣本滴加100 μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域,,室溫孵育10-30 min?;蛘邔⑤d玻片放入一個(gè)含有1×Equilibration Buffer的缸中,,保證緩沖液沒過樣本。在平衡細(xì)胞的同時(shí)在冰上解凍Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix,,并依照表1,,準(zhǔn)備足夠量的用于所有實(shí)驗(yàn)的和可選陽性對照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對于面積小于5 cm2的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng),,其體積是50 μL,用50 μL乘以實(shí)驗(yàn)和陽性對照反應(yīng)的數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積,。對于表面積更大的樣本,,可成比例的增大試劑體積。

    1準(zhǔn)備用于實(shí)驗(yàn)的和可選陽性對照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液

    組分

    體積(μL/50 μL體系)

    ddH2O

    34

    5×Equilibration Buffer

    10

    Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix

    5

    Recombinant TdT Enzyme

    1

    【陰性對照體系】:準(zhǔn)備一份不含TdT酶的對照孵育緩沖液,,用ddH2O替代TdT酶,。

    3.3在平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙洗掉100 μL 1×Equilibration Buffer中的大部分,,然后在5 cm2面積的細(xì)胞上加入50 μL TdT孵育緩沖液,。不要讓細(xì)胞干掉。這之后的操作,,載玻片要避光,。

    3.4把塑料蓋玻片蓋在細(xì)胞上以保證試劑的平均分布,,在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾,。將載玻片置于濕盒內(nèi),在37℃孵育60 min,。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光,。

    【注】:塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。

    3.5,,移除塑料蓋玻片,,并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5 min,換用新鮮PBS再重復(fù)清洗2次,。

    3.6,,用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。

    【注】:為了降低背景,,載玻片在用PBS洗一遍后,,可再用含0.1% Triton X-1005 mg/mL BSA的PBS洗3次,每次5 min,,這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清楚較干凈,。

    3.7樣本在染色缸中染色,在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液(1 μg/mL,,用PBS新鮮配制并稀釋)的染色缸,,室溫放置5 min。(可選):樣本在染色缸中染色,,在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液(2 μg/mL,,用PBS新鮮配制并稀釋)的染色缸,室溫放置5 min,。

    3.8,,洗滌樣本,將載玻片浸入去離子水中,,室溫放置5分鐘,。重復(fù)兩次,總共洗三次,。

    3.9,,叩干載玻片上多余的水并向樣本區(qū)域加100 μL PBS保持樣本濕潤。

    3.10,,立即在熒光顯微鏡下分析樣本,,用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過濾裝置在520±20 nm的熒光下觀察綠色熒光;在620 nm下觀察PI的紅色熒光,,或在460 nm觀察藍(lán)色的DAPI,。如有必要,載玻片能在4℃黑暗條件下存放過夜,?!咀ⅰ浚篜I/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,只在凋亡的細(xì)胞核中才有Alexa Fluor 488-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。

    四,、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測懸浮細(xì)胞

    4.13-5×106個(gè)細(xì)胞PBS在4℃離心(300×g)洗兩次,4℃ 300 g離心10 min,,然后重懸在0.5 mL PBS中,。

    4.2固定細(xì)胞,,加入5 mL 1%配制于PBS中的多聚\醛溶液,,冰上放置20 min。

    4.3,,細(xì)胞在4℃300×g離心10 min,,去上清并且重懸于5 mL PBS。重復(fù)洗一次,,并用0.5 mL PBS重懸細(xì)胞,。

    4.4通透細(xì)胞,,加入5 mL冰上預(yù)冷的70%乙醇,,在-20℃孵育4小時(shí)。細(xì)胞能在70%乙醇中-20℃條件下保存一周,,或者細(xì)胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透,,室溫放置5 min。

    4.5,,細(xì)胞在300×g離心10 min,,并用5 mL PBS重懸。重復(fù)離心,,并1 mL PBS重懸,。

    4.6轉(zhuǎn)移2×106個(gè)細(xì)胞至一個(gè)1.5 mL的微量離心管,。

    4.7300×g離心10 min,,去上清,,并用80 μL 1×Equilibration Buffer重懸。室溫孵育5 min,。

    4.8,,在平衡細(xì)胞的同時(shí),在冰上融解Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix,,并依照表1,,準(zhǔn)備足夠量用于所有反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對于2×106個(gè)細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng),,其體積是50 μL,,50 μL乘上反應(yīng)數(shù)目即所需TdT孵育緩沖液的總體積。

    4.9細(xì)胞在300×g離心10 min,,去上清并把沉淀重懸在50μL TdT孵育緩沖液中,,37℃孵育60 min,避光,。每隔15 min用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞,。


    4.10加入1 mL 20 mM EDTA終止反應(yīng),,用微量移液器輕柔混勻,。

    4.11300g離心10 min,,棄上清并把沉淀重懸在1 mL配制于PBS中0.1% Triton X-100溶液,,其中含5 mg/mL BSA,重復(fù)一次,,總共洗2次,。

    4.12300 g離心10 min棄上清,,細(xì)胞重懸于0.5 mL用PBS新配制的5μg/mLPI溶液中,,其中包含250 μg無DNA酶的RNA酶A。

    4.13,,在黑暗中室溫孵育細(xì)胞30 min,。

    4.14用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞,,在520±20 nm的熒光下觀察綠色熒光,;在>620 nm下觀察PI的紅色熒光。PI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色,,只在凋亡的細(xì)胞核中才有Alexa Fluor 488-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。

    HB220221






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