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參考價(jià): | 面議 |
- 40307ES20 產(chǎn)品型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù):3608更新時(shí)間:2022-11-07 15:24:05
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- 網(wǎng)址:
- www.yeasen.com
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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 20T |
---|---|---|---|
貨號 | 40307ES20 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品編號
規(guī)格
價(jià)格(元)
*(元)
TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488)
40307ES20
20 T
1250.00
1188.00
40307ES50
50 T
3080.00
2926.00
40307ES60
100 T
4800.00
4320.00
產(chǎn)品描述
細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí),,會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶,,這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA,。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測,可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder,。
TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 488)可以用來檢測組織細(xì)胞在凋亡晚期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況,。其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的作用下,在基因組DNA斷裂時(shí)暴露出的3′-羥基(3′-OH)末端摻入Alexa Fluor 488-12-dUTP,,從而可以用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測,。
Alexa Fluor 488染料穩(wěn)定性更高,信號更強(qiáng),,從而使標(biāo)記物更亮,,抗淬滅能力更強(qiáng)。
本試劑盒應(yīng)用范圍廣,,可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況,,也可檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。
產(chǎn)品組分
組分編號
組分名稱
產(chǎn)品編號/規(guī)格
40307ES20(20 T)
40307ES50(50 T)
40307ES60(100 T)
40307-A
5×Equilibration Buffer
750 μL
1.25 mL×2
1.25 mL×3
40307-B
Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix
100 μL
250 μL
250 μL×2
40307-C
Recombinant TdT Enzyme
20 μL
50 μL
50 μL×2
40307-D
Proteinase K(2 mg/mL)
40 μL
100 μL
100 μL×2
40307-E
DNase I (1 U/μL)
5μL
12.5 μL
25 μL
40307-F
10 × DNase I Buffer with MgCl2
100 μL
250 μL
500 μL
運(yùn)輸與保存方法
冰袋(wet ice)運(yùn)輸,。
本試劑盒儲(chǔ)存在-20℃,,Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix避光儲(chǔ)存于-20℃,有效期為1年,。
注意事項(xiàng)
1,、需自備用于洗滌細(xì)胞的PBS,,用于封片的抗熒光淬滅封片液,用于固定的4%多聚甲醛,。
2,、為了您的安全和健康,,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。
3、本產(chǎn)品僅作科研用途,!
操作步驟
一,、樣品準(zhǔn)備
1.1, 石蠟包埋組織切片
1.1.1,,室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5 min,,重復(fù)一次,以*脫掉石蠟,。
1.1.2,,室溫下用100%乙醇浸泡切片5 min,重復(fù)一次,。
1.1.3,,室溫下用梯度乙醇(90、80,、70%)各浸洗1次,,每次3 min。
1.1.4,,用PBS輕輕潤洗切片,,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。此時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作,。在實(shí)驗(yàn)過程中切勿讓樣品干燥,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤,。
1.1.5,,按1:100的比例,用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液,,使其終濃度為20 μg/mL,。
1.1.6,每個(gè)樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液,,使其被全部覆蓋,,室溫孵育20 min。
【注】:Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),,過短則可能造成透性處理不充分,,影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果,,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間,。
1.1.7,PBS溶液潤洗樣本2-3次,,輕輕去掉多余液體,,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本濕潤,。
1.2,,組織冰凍切片
1.2.1,取出冰凍切片,,并回溫至室溫,。將玻片浸沒在4%多聚甲\醛溶液(溶于PBS)中固定,室溫下孵育30 min,。
1.2.2,,輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體,。
1.2.3,,將玻片浸沒在PBS溶液中,室溫孵育15 min,,重復(fù)PBS洗一次,,共2次。
1.2.4,,輕輕去掉多余液體,,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。此時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作,。在實(shí)驗(yàn)過程中,切勿讓樣品干燥,,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤,。
1.2.5,按1:100的比例,,用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液,,使其終濃度為20 μg/mL。
1.2.6,,每個(gè)樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液,,使其被全部覆蓋,室溫孵育10 min,?!咀ⅰ浚篜roteinase K幫助組織和細(xì)胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),過短則可能造成透性處理不充分,,影響標(biāo)記效率,。未得到更好的結(jié)果,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間,。
1.2.7,,在盛有PBS溶液的敞口燒杯中潤洗樣本2-3次。
【注】:為了避免在清洗步驟中的樣本脫片損失,,建議不用洗瓶清洗,,而是將玻片浸在PBS溶液中2-3次進(jìn)行清洗,。
1.2.8,,輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤,。
1.3,細(xì)胞爬片的準(zhǔn)備
在Lab-Tek載波片小室(Chamber Slides)上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞,。在凋亡誘導(dǎo)處理之后,,用PBS洗2遍載玻片。
1.4,,細(xì)胞涂片的制備(以多聚賴氨酸包被的載玻片為例)
1.4.1,,以約2×107個(gè)細(xì)胞/mL的濃度將細(xì)胞重懸于PBS中,吸取50-100 μL細(xì)胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上,,用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細(xì)胞懸液,。
1.4.2,固定細(xì)胞,,將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,,在4℃放置25 min。
1.4.3,,洗滌載玻片,,將其浸入PBS中,室溫放置5 min,。重復(fù)用PBS洗一次,。
1.4.4,輕輕去掉多余液體,,并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體,。這時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓,便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作,。在實(shí)驗(yàn)過程中,,切勿讓樣品干燥,,處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。
1.4.5,,按1:100的比例,,用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液,使其終濃度為20 μg/mL,。
1.4.6每個(gè)樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液,,使其被全部覆蓋,室溫孵育5 min(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中,,室溫孵育5 min進(jìn)行通透處理),。【注】:Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透,。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn),,過短則可能造成透性處理不充分,影響標(biāo)記效率,。未得到更好的結(jié)果,,可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間。
1.4.7,,PBS潤洗樣本2-3次,,輕輕去掉多余液體,并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。處理后的樣本放在濕盒中,。
二、DNA酶處理陽性對照的步驟
在樣本通透處理后,,用DNA酶I處理細(xì)胞來準(zhǔn)備陽性對照載玻片,。該流程通常會(huì)引起被處理的大多數(shù)細(xì)胞顯現(xiàn)綠色熒光。
【注】:DNA酶I處理固定的細(xì)胞會(huì)引起染色體DNA的斷裂,,產(chǎn)生許多可標(biāo)記的DNA 3’-末端,。
2.1, 按1:10的比例用去離子水稀釋10×DNase I Buffer(每個(gè)樣本需用200 µL 1×DNase I Buffer,,即需要用20 µL 10×DNase I Buffer和180 µL去離子水混合稀釋),,取其中100 µL滴加到已通透的樣本上,室溫孵育5min,。 向剩余100 μL 1×DNase I Buffer中加1 μL DNase I (1U/μL),,使其終濃度為10 U/mL。
2.2,,輕輕叩掉液體,,加入100 μL含10 U/mL DNase I 的緩沖液,室溫孵育10 min。
2.3,,輕叩載玻片,,去掉多余的液體,并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中*洗3-4次,。
【注】:陽性對照載玻片必須使用單獨(dú)的染色缸,,否則陽性對照載玻片上殘余的DNase I 可能會(huì)在實(shí)驗(yàn)載玻片上引入高背景。
三,、標(biāo)記與檢測
3.1,,按1:5的比例用去離子水稀釋適量5×Equilibration Buffer(每個(gè)樣品需要100 μL 1×Equilibration Buffer)。
3.2,,每個(gè)樣本滴加100 μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域,,室溫孵育10-30 min?;蛘邔⑤d玻片放入一個(gè)含有1×Equilibration Buffer的缸中,,保證緩沖液沒過樣本。在平衡細(xì)胞的同時(shí)在冰上解凍Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix,,并依照表1,,準(zhǔn)備足夠量的用于所有實(shí)驗(yàn)的和可選陽性對照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對于面積小于5 cm2的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng),,其體積是50 μL,用50 μL乘以實(shí)驗(yàn)和陽性對照反應(yīng)的數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積,。對于表面積更大的樣本,,可成比例的增大試劑體積。
表1準(zhǔn)備用于實(shí)驗(yàn)的和可選陽性對照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液
組分
體積(μL/50 μL體系)
ddH2O
34
5×Equilibration Buffer
10
Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix
5
Recombinant TdT Enzyme
1
【陰性對照體系】:準(zhǔn)備一份不含TdT酶的對照孵育緩沖液,,用ddH2O替代TdT酶,。
3.3,在平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙洗掉100 μL 1×Equilibration Buffer中的大部分,,然后在5 cm2面積的細(xì)胞上加入50 μL TdT孵育緩沖液,。不要讓細(xì)胞干掉。這之后的操作,,載玻片要避光,。
3.4,把塑料蓋玻片蓋在細(xì)胞上以保證試劑的平均分布,,在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾,。將載玻片置于濕盒內(nèi),在37℃孵育60 min,。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光,。
【注】:塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。
3.5,,移除塑料蓋玻片,,并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5 min,換用新鮮PBS再重復(fù)清洗2次,。
3.6,,用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。
【注】:為了降低背景,,載玻片在用PBS洗一遍后,,可再用含0.1% Triton X-100和5 mg/mL BSA的PBS洗3次,每次5 min,,這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清楚較干凈,。
3.7樣本在染色缸中染色,在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液(1 μg/mL,,用PBS新鮮配制并稀釋)的染色缸,,室溫放置5 min。(可選):樣本在染色缸中染色,,在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液(2 μg/mL,,用PBS新鮮配制并稀釋)的染色缸,室溫放置5 min,。
3.8,,洗滌樣本,將載玻片浸入去離子水中,,室溫放置5分鐘,。重復(fù)兩次,總共洗三次,。
3.9,,叩干載玻片上多余的水并向樣本區(qū)域加100 μL PBS保持樣本濕潤。
3.10,,立即在熒光顯微鏡下分析樣本,,用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過濾裝置在520±20 nm的熒光下觀察綠色熒光;在>620 nm下觀察PI的紅色熒光,,或在460 nm觀察藍(lán)色的DAPI,。如有必要,載玻片能在4℃黑暗條件下存放過夜,?!咀ⅰ浚篜I/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色,只在凋亡的細(xì)胞核中才有Alexa Fluor 488-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。
四,、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測懸浮細(xì)胞
4.1,將3-5×106個(gè)細(xì)胞用PBS在4℃離心(300×g)洗兩次,4℃ 300 g離心10 min,,然后重懸在0.5 mL PBS中,。
4.2,固定細(xì)胞,,加入5 mL 1%配制于PBS中的多聚\醛溶液,,冰上放置20 min。
4.3,,細(xì)胞在4℃300×g離心10 min,,去上清并且重懸于5 mL PBS。重復(fù)洗一次,,并用0.5 mL PBS重懸細(xì)胞,。
4.4,通透細(xì)胞,,加入5 mL冰上預(yù)冷的70%乙醇,,在-20℃孵育4小時(shí)。細(xì)胞能在70%乙醇中-20℃條件下保存一周,,或者細(xì)胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透,,室溫放置5 min。
4.5,,細(xì)胞在300×g離心10 min,,并用5 mL PBS重懸。重復(fù)離心,,并1 mL PBS重懸,。
4.6,轉(zhuǎn)移2×106個(gè)細(xì)胞至一個(gè)1.5 mL的微量離心管,。
4.7,300×g離心10 min,,去上清,,并用80 μL 1×Equilibration Buffer重懸。室溫孵育5 min,。
4.8,,在平衡細(xì)胞的同時(shí),在冰上融解Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix,,并依照表1,,準(zhǔn)備足夠量用于所有反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對于2×106個(gè)細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng),,其體積是50 μL,,50 μL乘上反應(yīng)數(shù)目即所需TdT孵育緩沖液的總體積。
4.9,細(xì)胞在300×g離心10 min,,去上清并把沉淀重懸在50μL TdT孵育緩沖液中,,37℃孵育60 min,避光,。每隔15 min用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞,。
4.10,加入1 mL 20 mM EDTA終止反應(yīng),,用微量移液器輕柔混勻,。
4.11,300g離心10 min,,棄上清并把沉淀重懸在1 mL配制于PBS中的0.1% Triton X-100溶液,,其中含5 mg/mL BSA,重復(fù)一次,,總共洗2次,。
4.12,300 g離心10 min棄上清,,細(xì)胞重懸于0.5 mL用PBS新配制的5μg/mLPI溶液中,,其中包含250 μg無DNA酶的RNA酶A。
4.13,,在黑暗中室溫孵育細(xì)胞30 min,。
4.14,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞,,在520±20 nm的熒光下觀察綠色熒光,;在>620 nm下觀察PI的紅色熒光。PI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色,,只在凋亡的細(xì)胞核中才有Alexa Fluor 488-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。
HB220221