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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是用FITC標(biāo)記的Annexin V作為探針，來檢測細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生,。

其檢測原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲,、氨酸（phosphotidylserine,，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中,，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面,，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白,，能與PS高親和力結(jié)合，可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲,、氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合,。

另外,，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞,。PI是一種核酸染料,，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅,。因此,，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI則被排除在活細(xì)胞（Annexin V^-/PI^-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V⁺/PI^-）之外,，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V⁺/PI⁺）,。

本試劑盒可用于流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡進行檢測,。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸,。-20 ℃避光長期保存，避免反復(fù)凍融,，一年有效,。

【注】：如果需要在短時間內(nèi)多次重復(fù)使用，可以在4 ℃避光保存,，半年有效,。

注意事項

1）由于細(xì)胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內(nèi)進行分析,。

2）對于貼壁細(xì)胞,，消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時如有漂浮細(xì)胞,，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色,。處理貼壁細(xì)胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷,。胰\酶消化時間過短,，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷,；PI攝入過多,，消化時間過長，細(xì)胞膜同樣易造成損傷,，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲,、氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合。消化時將胰\酶鋪滿孔板底后,，輕搖使胰\酶與細(xì)胞充分接觸,，然后倒掉大部分胰\酶，利用剩余少量胰\酶再消化一段時間，待細(xì)胞間空隙增大,，瓶底呈花斑狀即可終止,。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結(jié)合,。

3）實驗中如需要固定細(xì)胞,，比如在檢測凋亡的同時檢測細(xì)胞周期，只能選用Annexin V-FITC,，而不能選用Annexin V-EGFP,，因為在固定過程中EGFP會變性導(dǎo)致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細(xì)胞與Annexin V-FITC進行孵育,，并用Binding buffer洗掉未結(jié)合的Annexin V-FITC,。因為固定過程中細(xì)胞通透性增加會產(chǎn)生細(xì)胞碎片，可以和Annexin V結(jié)合,，對結(jié)果產(chǎn)生干擾,。

4）如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板,。因為血小板含有PS,，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實驗結(jié)果,?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

5）試劑在開蓋前請短暫離心,，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底,，避免開蓋時液體灑落。

6）Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì),，在操作時請注意避,。

操作方法

1.1 樣品染色

1）懸浮細(xì)胞：300 g，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞,。

貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰\酶消化后,，300 g，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞,。胰\酶消化時間不宜過長,，以防引起假陽性。

2）用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,，每次均需300 g,，4 ℃離心5 min。收集1～5×10⁵細(xì)胞,。

3）吸棄PBS,，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,。

4）加入5 μL Annexin V-FITC和10 μLPI Staining Solution，輕輕混勻,。

5）避光,、室溫反應(yīng)10~15 min,。

6）加入400 μL 1×Binding Buffer,，混勻后放置于冰上，樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測,。

【注】：為了避免洗滌細(xì)胞時損失細(xì)胞,，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

1.2 樣品分析

A．流式細(xì)胞儀分析：

FITC大激發(fā)波長為488 nm,，大發(fā)射波長525 nm,，F(xiàn)ITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復(fù)合物的大激發(fā)波長為535 nm,，大發(fā)射波長為615 nm,，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析,，繪制雙色散點圖（two-color dot plot）,，FITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo),。典型的實驗中,，細(xì)胞可以分成三個亞群，活細(xì)胞僅有很低強度的背景熒光,，早期凋亡細(xì)胞僅有較強的綠色熒光,，晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

B．熒光顯微鏡分析：

1）滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細(xì)胞懸液于載玻片上,，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞,。

【注】：對于貼壁細(xì)胞，可直接用蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,。

2）在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察,。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色,。

數(shù)據(jù)展示

數(shù)據(jù)來源：上海交通大學(xué)納米生物工程研究所,；

文章信息：Cui, D., et al., Regression of Gastric Cancer by Systemic Injection of RNA Nanoparticles Carrying both Ligand and siRNA. Sci Rep, 2015. 5: p. 10726.

細(xì)胞類型：MGC803 cells；

所用試劑：Yeasen,，Cat：40302,，Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit 。

“Fig5.Determination of cell death by flow cytometry of Annexin V-FITC/PI staining in MGC803 cells transfected with 25 nM FA-pRNA-3WJ-BRCAA1siRNA or FA-pRNA-3WJ-Scram-siRNA for 48 h."

數(shù)據(jù)來源：中山大學(xué),；

文章信息：Zhou, T., et al., Mild hypothermia protects against oxygen glucose deprivation/reoxygenation-induced apoptosis via the Wnt/beta-catenin signaling pathway in hippocampal neurons. Biochem Biophys Res Commun, 2017. 486(4): p. 1005-1013.

細(xì)胞類型：Hippocampal neurons,；

所用試劑：Yeasen,，Cat：40302 ，Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit,。

“Fig. 3. Wnt/b-catenin mediates the expression levels of apoptosis-related proteins and the protective effects of mild hypothermia against OGD/R-induced apoptosis,。scatter diagram of PI/Annexin V gating from different groups. a. Control; b.OGD/R; c.OGD/R t MH(24 h); d.OGD/R t MH(24 h)tDkk1; e. OGD/R t Dkk1."

相關(guān)產(chǎn)品

HB200309