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從組織中獲取DNA難嗎,？不難，真不難,。高一就有開設(shè)的從雞血中獲取DNA的生物實驗課,，很簡單的幾步就可以得到DNA。但要想獲取高質(zhì)量的DNA,，尤其是從一些富含多糖、多酚,、淀粉,、纖維和蛋白的組織,，后面用于酶切、高通量測序大片段文庫的構(gòu)建,還是有一定的難度的,。
zui近協(xié)助北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心一個老師提取桃葉片DNA還是遇到了一些困難,，因為老師要做桃的個體重測序，因此對DNA的要求還是非常高的,。之前跟其他很多老師交流植物DNA的提取,，大多數(shù)目前仍然使用CTAB法，有些老師購買試劑盒進行提取,，其實很多植物DNA提取試劑盒成分也是CTAB,。CTAB法是提取植物DNA非常經(jīng)典方法，但在提取的過程中由于要在65℃水浴中放置1個小時,，因此耗時較長,。我們在使用該法提取桃DNA時，獲得DNA中含有大量的蛋白和多糖,，雖然通過多次的苯酚氯仿抽提可以大部分去除,，但DNA得率較低。在這里給大家分享一種快速獲取植物高質(zhì)量DNA的方法,，供大家在提取植物DNA時作為參考,，用該法提取的植物DNA*后續(xù)酶切、BAC文庫構(gòu)建,、高通量測序大片段文庫構(gòu)建,，將該法稱之為月桂酸鈉法。
月桂酸鈉抽提緩沖液：
Tris-Hcl（pH8.0）100mmol/L,；NaCl 100mmol/L,；EDTA（pH8.0）20mmol/L；月桂酸鈉 1%,；
配法：準(zhǔn)確稱取NaCl 5.844g,，月桂酸鈉 10g置于1000mL燒杯中，加入100ml Tris-Hcl（1M）以及40mLEDTA（0.5M）,、800mlddH2O,，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至1000 mL,，滅菌后室溫保存,。
月桂酸鈉英文名稱：sodium lauroyl sarcosine 分子式：C15H28NaO3N，分子量：293.39,。
以該法大量獲取玉米葉片DNA為例的實驗流程：
（1）選取適量的玉米幼苗新鮮葉片,，以紗布捆扎，做好標(biāo)記，置于液氮中保存,；
（2）研缽以液氮預(yù)冷,，將玉米葉片置于研缽中，倒入液氮,，迅速研磨至粉末級,，期間時時加入液氮，防止研磨過程中DNA被降解,；
（3）將研磨好的粉末移入滅菌后的50mL抽提試管中,，用移液管加入10mL月桂酸鈉抽提緩沖液，反復(fù)緩慢的搖勻,；
（4）用移液管向50mL抽提試管中加入等體積（10mL）酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）,，反復(fù)緩慢的搖勻；
（5）12000 rpm,，4°C離心20min后取出,，小心吸取上清液16mL于新滅菌的50ml抽提試管中；
（6）向上述抽提試管中加入12mL異丙醇,，上下緩慢顛倒數(shù)次,，有白色絮狀沉淀析出，顛倒時注意往一個方向,，防止沉淀散開,，不利于后續(xù)實驗；
（7）將白色絮狀沉淀用槍頭從抽提試管中輕輕挑出,，至于2mL EP管中,；
（8）向上述2mL EP管中加入1.8mL70%乙醇，反復(fù)輕輕震蕩洗滌,，4°C,，12000 rpm，高速離心15min,，棄上清,，重復(fù)此步驟兩次；
（9）將得到的白色沉淀再次4°C,，12000 rpm短暫離心數(shù)秒,，以移液器吸干殘留乙醇；
（10）白色沉淀置于37°C干燥箱中,，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈,，這個過程中要經(jīng)常拿出觀察，防止過度烘干,，不利于后面溶解,；
（11）待白色沉淀變透明后，向2mLEP管中加入0.9mLTE緩沖液（pH8.0），放置于65℃恒溫箱中,，期間輕微彈勻,，使DNA充分溶解；
（12）DNA*溶解后,，加入5μL RNase（0.1mg/mL），置于37°C干燥箱中30min,，消化RNA,，取出3μL，以1%瓊脂糖膠檢測是否有RNA殘留,；
（13）待RNA消化完成后,，向EP管中加入等體積（0.9mL）氯仿，輕輕搖勻,；
（14）4°C,，12000 rpm高速離心15min；
（15）吸取0.7mL上清置于1.5ml新EP管中,，加入1/10體積（約0.07mL）NaAc（3M/L）溶液,，輕輕搖勻；
（16）向上述EP管中加入等體積（0.7mL）異丙醇,，輕輕搖勻后,，于-20°C靜置20min；
（17）4°C,，12000 rpm高速離心15min,，棄上清；
（18）將得到的白色沉淀以70%乙醇洗滌兩次,，去除殘留的乙醇,；
（19）白色沉淀置于37°C干燥箱中，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈,，該過程中要經(jīng)常拿出觀察,，防止烘干過度，不利于后面溶解,；
（20）待白色沉淀變透明,，管中無殘留的乙醇味后，加入200μL TE（pH8.0）,，于37°C干燥箱中溶解,；
（21）待DNA*溶解后，取出1μL,，以分光光度計測定OD值,，分裝后于保存（-20°C）。
以該法獲取的玉米葉片DNA電泳圖如下：
DNA提取過程中常見問題及建議解決方案：
來源：http://blog.sciencenet.cn/blog-657244-721856.html
DNA提取過程中常見問題及建議解決方案：
來源：http://blog.sciencenet.cn/blog-657244-721856.html
