聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級會員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號中華門大廈18樓D座
- 個性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機商鋪
從組織中獲取DNA難嗎？不難,，真不難。高一就有開設(shè)的從雞血中獲取DNA的生物實驗課，很簡單的幾步就可以得到DNA,。但要想獲取高質(zhì)量的DNA，尤其是從一些富含多糖,、多酚,、淀粉、纖維和蛋白的組織,，后面用于酶切,、高通量測序大片段文庫的構(gòu)建,還是有一定的難度的。
zui近協(xié)助北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心一個老師提取桃葉片DNA還是遇到了一些困難,，因為老師要做桃的個體重測序,，因此對DNA的要求還是非常高的。之前跟其他很多老師交流植物DNA的提取,，大多數(shù)目前仍然使用CTAB法,，有些老師購買試劑盒進行提取,，其實很多植物DNA提取試劑盒成分也是CTAB。CTAB法是提取植物DNA非常經(jīng)典方法,，但在提取的過程中由于要在65℃水浴中放置1個小時,，因此耗時較長。我們在使用該法提取桃DNA時,，獲得DNA中含有大量的蛋白和多糖,，雖然通過多次的苯酚氯仿抽提可以大部分去除，但DNA得率較低,。在這里給大家分享一種快速獲取植物高質(zhì)量DNA的方法,，供大家在提取植物DNA時作為參考，用該法提取的植物DNA*后續(xù)酶切,、BAC文庫構(gòu)建,、高通量測序大片段文庫構(gòu)建，將該法稱之為月桂酸鈉法,。
月桂酸鈉抽提緩沖液：
Tris-Hcl（pH8.0）100mmol/L,；NaCl 100mmol/L；EDTA（pH8.0）20mmol/L,；月桂酸鈉 1%,；
配法：準確稱取NaCl 5.844g，月桂酸鈉 10g置于1000mL燒杯中,，加入100ml Tris-Hcl（1M）以及40mLEDTA（0.5M）,、800mlddH2O，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0,，定容至1000 mL,，滅菌后室溫保存。
月桂酸鈉英文名稱：sodium lauroyl sarcosine 分子式：C15H28NaO3N,，分子量：293.39,。
以該法大量獲取玉米葉片DNA為例的實驗流程：
（1）選取適量的玉米幼苗新鮮葉片，以紗布捆扎,，做好標記,，置于液氮中保存；
（2）研缽以液氮預(yù)冷,，將玉米葉片置于研缽中,，倒入液氮，迅速研磨至粉末級,，期間時時加入液氮,，防止研磨過程中DNA被降解；
（3）將研磨好的粉末移入滅菌后的50mL抽提試管中,，用移液管加入10mL月桂酸鈉抽提緩沖液,，反復(fù)緩慢的搖勻,；
（4）用移液管向50mL抽提試管中加入等體積（10mL）酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），反復(fù)緩慢的搖勻,；
（5）12000 rpm,，4°C離心20min后取出，小心吸取上清液16mL于新滅菌的50ml抽提試管中,；
（6）向上述抽提試管中加入12mL異丙醇,，上下緩慢顛倒數(shù)次，有白色絮狀沉淀析出,，顛倒時注意往一個方向,，防止沉淀散開，不利于后續(xù)實驗,；
（7）將白色絮狀沉淀用槍頭從抽提試管中輕輕挑出,，至于2mL EP管中；
（8）向上述2mL EP管中加入1.8mL70%乙醇,，反復(fù)輕輕震蕩洗滌，4°C,，12000 rpm,，高速離心15min，棄上清,，重復(fù)此步驟兩次,；
（9）將得到的白色沉淀再次4°C，12000 rpm短暫離心數(shù)秒,，以移液器吸干殘留乙醇,；
（10）白色沉淀置于37°C干燥箱中，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈,，這個過程中要經(jīng)常拿出觀察,，防止過度烘干，不利于后面溶解,；
（11）待白色沉淀變透明后,，向2mLEP管中加入0.9mLTE緩沖液（pH8.0），放置于65℃恒溫箱中,，期間輕微彈勻,，使DNA充分溶解；
（12）DNA*溶解后,，加入5μL RNase（0.1mg/mL）,，置于37°C干燥箱中30min，消化RNA,，取出3μL,，以1%瓊脂糖膠檢測是否有RNA殘留,；
（13）待RNA消化完成后，向EP管中加入等體積（0.9mL）氯仿,，輕輕搖勻,；
（14）4°C，12000 rpm高速離心15min,；
（15）吸取0.7mL上清置于1.5ml新EP管中,，加入1/10體積（約0.07mL）NaAc（3M/L）溶液，輕輕搖勻,；
（16）向上述EP管中加入等體積（0.7mL）異丙醇,，輕輕搖勻后，于-20°C靜置20min,；
（17）4°C,，12000 rpm高速離心15min，棄上清,；
（18）將得到的白色沉淀以70%乙醇洗滌兩次,，去除殘留的乙醇；
（19）白色沉淀置于37°C干燥箱中,，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈,，該過程中要經(jīng)常拿出觀察，防止烘干過度,，不利于后面溶解,；
（20）待白色沉淀變透明，管中無殘留的乙醇味后,，加入200μL TE（pH8.0）,，于37°C干燥箱中溶解；
（21）待DNA*溶解后,，取出1μL,，以分光光度計測定OD值，分裝后于保存（-20°C）,。
以該法獲取的玉米葉片DNA電泳圖如下：
DNA提取過程中常見問題及建議解決方案：
來源：http://blog.sciencenet.cn/blog-657244-721856.html
DNA提取過程中常見問題及建議解決方案：
來源：http://blog.sciencenet.cn/blog-657244-721856.html
