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磷酸鈣-DNA 共沉淀法

核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現(xiàn)時,，可使DNA 附在細(xì)胞表面,，利于細(xì)胞吞入攝取,，或通過細(xì)胞膜脂相收縮時裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),，進(jìn)入細(xì)胞的DNA 僅有1%～5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中,，其中僅有不到1%的DNA 可以與細(xì)胞DNA 整合,，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4,，這項技術(shù)能用于任何DNA 導(dǎo)入哺乳類動物進(jìn)行暫時性表達(dá)或長期轉(zhuǎn)化的研究,。此方法對于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是zui常用并的方法。

1,、配液

（1）2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na₂ PO4 ,、2H₂ O

加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存

（2）2mmol/L CaCl₂ 過濾除菌

（3）TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

（4）G418（新霉素G418）液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中,，加H₂O至10mL過濾除菌4℃保存,。

（5）G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200～800mg/L

注意：對受體細(xì)胞先做預(yù)試驗,，選用濃度為在10～14天內(nèi)能殺死細(xì)胞50%以上的zui低濃度。

2,、操作步驟[方法一]：

（1）供體DNA 制備：方法按前介紹的DNA 提取法提取,，溶于TE中,，40mg/L。

（2）受體細(xì)胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類Alu序列的動物細(xì)胞系作為受體細(xì)胞,。如小鼠NIH3T3胚成纖維細(xì)胞系等,，該細(xì)胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向，一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞,，接種密度為2×104 /cm² ,用含10%胎牛血清的DMEM液,，37℃、5%CO₂ 培養(yǎng),，待細(xì)胞占50～70%瓶底面積時,，用于轉(zhuǎn)染試驗。

（3）DNA -磷酸鈣沉淀物的制備

①將供體細(xì)胞DNA 和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA 用TE配制成40mg/L的DNA 溶液,，同時向供體細(xì)胞DNA 液200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA 液（20mg/L）220μl和2×HBS 250μl（PSV2-neo為1～2mg/L的使用量）,。

②取500μl上述DNA 溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml,、2mol/L CaCl₂ 混勻30秒,。

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘,，待溶液輕度混濁后,，吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。

（4）轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

①將處于對數(shù)生長期已占瓶底50～70%的受體細(xì)胞,，在轉(zhuǎn)染前4小時更換一次新鮮培養(yǎng)基,，每瓶5ml（25ml培養(yǎng)瓶）。

②吸取0.5ml DNA -磷酸鈣沉淀,，加入含5ml培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中搖勻,。

③置37℃ 5% CO₂ 培養(yǎng)24h或更長，使細(xì)胞充分吸入DNA -磷酸鈣結(jié)晶顆粒,。

④更換新鮮培養(yǎng)基,，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá),。

⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選,。同時設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞。

⑥培養(yǎng)大約3～5天,，對照細(xì)胞大部分死亡,，這時轉(zhuǎn)染細(xì)胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每3～4天更換一次選擇培養(yǎng)基,。

⑦2周后對照細(xì)胞死亡,，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瓶中可見有抗藥性的細(xì)胞克隆 出現(xiàn)，待其增大后再進(jìn)行化和擴(kuò)大培養(yǎng),，可建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株,，并做進(jìn)一步鑒定,。

本實驗要加入PSV2-neo、DNA 與外源DNA 共轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞,，這樣可使受體細(xì)胞獲得新霉素（neo）基因的抗藥性,，這樣即使癌基因沒有出現(xiàn)明顯的“轉(zhuǎn)化灶”，也可測出轉(zhuǎn)入的外源性基因的抗neo的標(biāo)記,。而且還可利用被neo基因?qū)氲氖荏w細(xì)胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞建立細(xì)胞株,。若以獲取“轉(zhuǎn)化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA 只需將從癌細(xì)胞中提取的DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞即可,，其方法如下：

3,、DNA 轉(zhuǎn)染[方法二]：

（1）配制磷酸轉(zhuǎn)染液

NaCl 8.0g

Hepes 5.0g 用時現(xiàn)配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65

Na₂HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存?zhèn)溆?/p>

加溫水至 1000ml

（2）按前面介紹的方法提取癌細(xì)胞DNA ,。

（3）取供體DNA 50～100μg,加3M NaCl或醋酸鈉,，使zui終濃度至0.3M混勻。

（4）再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘,，去上清,。

（5）加入轉(zhuǎn)染緩沖液，待DNA 充分溶解后,，再加入2.5MCaCl₂ ,含zui終濃度為125mM,，用吸管輕輕吹打三次（不用攪拌器以防DNA 袢結(jié)），置室溫下10～30分鐘,，待液體透明度降低,，出現(xiàn)微濁蘭色時，即可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。

（6）取生長狀態(tài)良好處于半?yún)R合階段的對數(shù)生長期細(xì)胞,，在轉(zhuǎn)染前4小時，更換培養(yǎng)液（5ml/瓶）1次,。

（7）轉(zhuǎn)染：向每瓶中加DNA -磷酸鈣沉淀物0.5～1ml/瓶,，置37℃作用4～6小時。

（8）培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液,，用15%處理3分鐘,，無血清培養(yǎng)漂洗1次，接近匯合時血清用量降至5%,，培養(yǎng)2～3周,。

（9）檢測：逐日觀察，待出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”后,，分離,，擴(kuò)大培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株。

脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA 轉(zhuǎn)染法

脂質(zhì)體（lipofectin regeant,LR）試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2,，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1（w/w）],。它適用于把DNA 轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,，是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高,，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍,，能把DNA 和RNA 轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞,。

用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量,、作用時間等，對每批LR都要做：*,，先要固定一個DNA 的量和DNA /LR混合物與細(xì)胞相互作用的時間,，DNA 可從1～5μg和孵育時間6小時開始，按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線,，再選用LR和DNA 兩者*的劑量,，確定出轉(zhuǎn)染時間（2～24小時）。因LR對細(xì)胞有一定的毒性,，轉(zhuǎn)染時間以不超過24小時為宜,。

細(xì)胞種類：COS-7、BHK,、NIH3T3,、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。

1,、操作步驟[方法一]：

（1）：取6孔培養(yǎng)板（或用35mm培養(yǎng)皿）,，向每孔中加入2ml含1～2×10⁵ 個液，37℃CO₂ 培養(yǎng)至40%～60%匯合時（匯合過分,，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞）,。

（2）轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液（為轉(zhuǎn)染每一個孔細(xì)胞所用的量）A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA ，終量100μl,，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR,，終量100μl,輕輕混合A、B液,，室溫中置10-15分鐘,，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染（如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA 濃度過高所致,，應(yīng)酌情減量）,。

（3）轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2ml不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1ml不含血清培養(yǎng)液,。

（4）轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,，搖勻,，37℃溫箱置6～24小時，吸除無血清轉(zhuǎn)染液,，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。

（5）其余處理如觀察、篩選,、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同,。

注意：轉(zhuǎn)染時切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響,。

2,、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]：

（1）以5×10⁵ 細(xì)胞/孔接種6孔板（或35mm培養(yǎng)皿）培養(yǎng)24小時，使其達(dá)到50～60%板底面積,。

（2）在試管中配制DNA /脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

①在1ml無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA 或供體DNA ,。

②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液,，旋轉(zhuǎn),。

③室溫下放置5～10分鐘，使DNA 結(jié)合在脂質(zhì)體上,。

（3）棄去細(xì)胞中的舊液,，用1ml無血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入1ml DNA /脂質(zhì)體復(fù)合物,，37℃培養(yǎng)3～5小時,。

（4）再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14～24小時,，

（5）吸出DMEM/DNA /脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM,，2ml/孔，再培養(yǎng)24～48小時,。

（6）用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞,，以備分析鑒定。

穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

（1）接種細(xì)胞同前,，細(xì)胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染,。

（2）DNA /脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前（2）、（3）步驟,。

（3）在每孔中加入1ml,、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時,。

（4）吸出DMEM,，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長一定時間，篩選轉(zhuǎn)染克隆 ,，方法參照細(xì)胞篩選法進(jìn)行,。

DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法

DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其原理還不清楚,，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核,，此法只適合暫時轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細(xì)胞與DNA /DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關(guān)系,，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖（1g/L）作用較短時間（30分鐘-1.5小時）,，又可用較低濃度（250g/L）的DEAE-葡聚糖作用較長時間（8小時）。

方法如下：

（1）接種鼠L成纖維細(xì)胞濃度為5×10⁵ CO₂ /孔/皿生長2～3天,，當(dāng)達(dá)50%板底面積可用。

（2）乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質(zhì)粒DNA ,，空氣干燥后溶于40μL的TE中,，或取供體DNA 。

（3）用10ml 1×PBS,、4ml,、10%富合生長因子血清的DMEM洗板（皿）。

（4）在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA ,，取120μl DNA /DEAE-葡聚糖加到每孔（皿）細(xì)胞中,，使其分布均勻輕輕轉(zhuǎn)動直到顯示均勻一致的紅色，培養(yǎng)4小時,。

（5）從孔（皿）中吸出DNA /DEAE-葡聚糖,，加入5ml 10%DMSD，室溫放置1分鐘,，吸出DMSO,，用5ml 1×PBS洗一次吸出，加入10ml培養(yǎng)液（10%血清的DMEM）,。

（6）培養(yǎng)細(xì)胞,，在適當(dāng)時間分析細(xì)胞，若含有抗藥基因,，可用G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng),，方法同前。

*,，科研工作者在進(jìn)行醫(yī)藥方面的科學(xué)研究之前,，需要制定完善的統(tǒng)計研究設(shè)計方案，那么什么樣的設(shè)計方案才稱得上是完善的呢,？ 一般來說,，完善的設(shè)計方案需具備以下幾個條件：實驗所需的人力、物力和時間資源；實驗設(shè)計的“三要素”和“六原則”均符合專業(yè)和統(tǒng)計學(xué)要求,，對實驗數(shù)據(jù)的收集,、整理、分析等有一套規(guī)范的規(guī)定和正確的方法,。而其中準(zhǔn)確把握統(tǒng)計研究設(shè)計的“三要素和六原則”,，是科學(xué)實驗設(shè)計的核心。