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可在長達3‘的克隆化DN段上產(chǎn)生大量的隨機分布的核苷酸替換突變，在將DNA克隆到一個可用來分離單鏈DNA的載體后,，用各種可造成特定堿基損傷的化學試劑處理,。
實驗方法
- 基本方案
| 實驗材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑,、試劑盒 | 乙酸鈉 亞硝酸鈉 TE 無水乙醇 dNTP 反轉(zhuǎn)錄酶 RNA酶 洗脫液 溴化乙錠 |
| 儀器,、耗材 | 水浴鍋 培養(yǎng)箱 |
| 實驗步驟 | 1. 用限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA以獲得目的DN段,，將靶片段雙向克隆到M13噬菌體載體或含有M13復制起始子的質(zhì)粒載體中,。從100 ml 感染細抱培養(yǎng)物中提取單鏈DNA,。 2. 在三個微量離心管內(nèi)各加入40 μg 1 mg/ml 的單鏈DNA，如果靶序列的兩條鏈都要被利用,，則需用6個反應,。 3. 亞硝酸反應：在一個管內(nèi)加入10 μl pH4.3的2.5 mol/l 乙酸鈉和50 μl 2 mol/l 亞硝酸鈉，混勻,，室溫溫育60 min,。 4. 甲酸反應：在另一管內(nèi)加60 μl 濃甲酸，混勻,，室溫溫育10 min。 5. 肼反應：在第三個管內(nèi)加60 μl 濃肼,，混勻,，室溫溫育10 min。 6. 毎管加100 μl 2.5 mol/l pH5.5的乙酸鈉,，30 μg 擔體tRNA和1 ml 無水乙醇,，置干冰中凍至-80℃，放置10 min,，離心10 min,，去上清，重復乙醇沉淀兩次,，再用80 μl TE緩沖液重懸DNA,。 7. 在重懸的DNA內(nèi)加10 μl 4種dNTP混合液,，10 μl 10×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液和100 pmol 的寡核苷酸引物。先在85 ℃溫育5 min,，再于40℃溫育15 min,。 8. 加10 μl 4種dNTP混合液和30~40 U 的AMV反轉(zhuǎn)錄酶，37℃溫育1 h,。 9. 用緩沖液平衡酚抽提和乙醇沉淀DNA,，DNA重懸于100 μl 10×限制性內(nèi)切酶緩沖液，并用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割,，以便從載體中回收片段,。 10. 酚抽提和乙醇沉淀DNA。DNA重懸于10~15 μl 洗脫緩沖液,，并加0.5 μl 2 mg/ml RNA酶A,，37℃溫育15 min 以降解擔體tRNA。 11. 在非變性的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳上,，分離從載體上切下的目的片段,，凝膠用溴化乙錠染色，切膠,，洗脫出DNA,。 12. 將純化的插入DNA連接到具有互補末端的質(zhì)粒或細菌噬菌體載體中,。通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化程序?qū)⑦B接混合物導入合適的細菌中 |
