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DNA實驗技術:SNP實驗標準操作規(guī)程

2013-8-2  閱讀(1558)

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一,、原理

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性,,是由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism),。據(jù)估計,,在人類基因組中,,大約每千個堿基中有一個SNP,,無論是比較于限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析還是微衛(wèi)星標記(STR),,都要廣泛得多,。SNP是我們考察遺傳變異的zui小單位,據(jù)估計,人類的所有群體中大約存在一千萬個SNP位點,。一般認為,,相鄰的SNPs傾向于一起遺傳給后代。于是,,我們把位于染色體上某一區(qū)域的一組相關聯(lián)的SNP等位位點稱作單體型(haplotype),。大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個常見的單體型(每個具有至少5%的頻率),它們代表了一個群體中人與人之間的大部分多態(tài)性,。一個染色體區(qū)域可以有很多SNP位點,,但是我們一旦掌握了這個區(qū)域的單體型,,就可以只使用少數(shù)幾個標簽SNPs(tagSNP)來進行基因分型,獲取大部分的遺傳多態(tài)模式,。

二,、樣品準備

1. DNA抽提

①    1、取新鮮肌肉組織約100mg,,PBS漂洗干凈,,置于1.5ml離心管中,加入液氮,,迅速磨碎,。

②    加200μl 緩沖液GA,震蕩至*懸浮,。加入20μl 蛋白酶K(20mg/ml)溶液,,混勻

③    加220μl 緩沖液GB,充分混勻,,37℃消化,,溶液變清亮。加220μl 無水乙醇,,充分混勻,,此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。

④    將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB 中,,(吸附柱放入廢液收集管中)12000rpm 離心30 秒,,棄掉廢液,。

⑤    加入500μl 去蛋白液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),,12000rpm 離心30 秒,棄掉廢液,。

⑥    加入700μl 漂洗液GW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),,12000rpm離心30 秒,棄掉廢液,。加入500μl 漂洗液GW, 12000rpm 離心30 秒,,棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中,,12000rpm 離心2 分鐘,,盡量除去漂洗液。

⑦    將吸附柱CB 轉入一個干凈的離心管中,,加入100μl 洗脫緩沖液(洗脫緩沖液應在60-70℃水浴預熱),,混勻,室溫放置15 分鐘,,12000rpm 離心30 秒,。洗脫第二次,,將洗脫緩沖液50μl 加入吸附柱中,室溫放置15 分鐘,,12000rpm 離心30 秒,。

⑧    采用Beckman DU® 640 spectrophotometer 檢測提取到的基因組DNA 濃度,在OD260 處有顯著吸收峰,。同時檢測純度,,OD260/280 的值應為為1.7-1.9。

⑨    從原液中取出相應體積DNA 溶液,,稀釋致50ng/ul,,原液置于-70℃保存,稀釋液置于-20℃保存,。

2. PCR擴增目的片段

按相關的試劑說明在標準反應管中準備反應體系,,典型的PCR反應體系如下(20ul體系):

10×Buffer 2ul
Taq酶 1ul 
dNTP 0.5ul
上游引物 0.5ul
下游引物 0.5ul 
無菌水 14.5ul
DNA模板 1ul

向左扳動儀器蓋子上的手柄,揭開儀器蓋子,,小心放置樣品管于儀器的相應樣品孔中,,輕輕蓋上蓋子,將頂部的旋鈕慢慢旋緊,,讓熱蓋緊密接觸樣品管,,樣品放置完畢。

3. 在T1型PCR儀上編輯一個程序

按[C programs]進入編輯模式,。要在主目錄中創(chuàng)建一個程序請按[D enter],。要進入一個子目錄,用→鍵將光標向右移動,,然后用↑↓鍵選擇一個子目錄,。按[D enter]進入選擇的子目錄。

輸入程序中要求的溫度:用[D enter]確認溫度,。為其輸入時間,,用小數(shù)點來間隔。順序為h.m.s,。用[D enter]確認時間設置,,或者用光標鍵移動到下一個區(qū)域。#表示循環(huán)的次數(shù),。設定循環(huán)值=總循環(huán)值-1,,即,總循環(huán)數(shù)為30時應輸入“29”,。用[C pgm ok]來儲存一個完整的程序,。程序數(shù)據(jù)*的儲存在記憶中。

4. 運行程序

按[B start/stop]選擇一個程序,。用→↑↓鍵選擇一個子目錄,,或者用[D enter]進入主目錄,。輸入您想要啟動的程序的號碼?;蛘?,按[A list]在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個程序。用↑↓鍵在列表中滾動選擇,。用[D enter]確認用強光突出的程序,。按[D start]啟動程序。

5. 控制測試過程

運行過程中,,按A按鈕,,可以獲得程序剩余的時間信息。運行完成后,,按STOP按鈕終止實驗,,按YES確認終止。小心旋開熱蓋,,按照放置樣品的操作順序,,打開蓋子,取出實驗樣品,,再蓋上蓋子,,關閉電源,本次實驗結束,。

6. PCR產(chǎn)物測序

由專門負責測序的服務公司完成

7. 數(shù)據(jù)分析

少量可人工讀取,,大量可軟件讀取。比對發(fā)現(xiàn)的SNP在基因組中的位置:重點是啟動子區(qū),、外顯子區(qū)域(包括編碼區(qū)的cSNP及5’及3’UTR),、剪切邊界等,密碼子的改變是否導致氨基酸的改變:錯義突變,、無義突變,、終止突變。

8. 注意事項

①  為保證待測目的區(qū)域測序真實可靠,,引物設計應該使待測目的區(qū)域邊界距離上下游引物至少各50bp;

② 引物設計建議使用在線方式,,以保證成功率,;

③ 為保證測序敏感性,PCR產(chǎn)物片段大小應在250bp-650bp范圍,;

④ 為方便實驗,,建議引物合成時分裝成1 o.d/管,方便將PCR與測序的引物分開,;

⑤ 為保證引物的特異性,,建議引物設計后在NCBI上blast確認,;

⑥ 為防止降解,PCR產(chǎn)物應盡快測序,,否則應該保存在-20℃,,且時間不宜過長;

⑦ 為保證結果真實性,,建議對關鍵點進行反向測序確認,。

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