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實驗原理
干抗素是干擾素誘生劑作用于有關(guān)生物細胞所產(chǎn)生的一類高活性、多功能蛋白質(zhì)。它從細胞產(chǎn)生和釋放出來以后，又作用于相應的其它同種細胞，使其獲得抗病毒及抗腫瘤等多方面的免疫力,。
所謂干擾素誘生劑，是指能誘導有關(guān)生物細胞產(chǎn)生干擾素的一類物質(zhì),。能誘導有關(guān)生物細胞產(chǎn)生α和β干擾素者稱甲類干擾素誘生劑,，如各種動物病毒、細胞內(nèi)寄生的微生物等,；可誘導T細胞產(chǎn)生γ干擾素的稱為乙類干擾素誘生劑,，如脂多糖、鏈球菌毒素,、腸毒素A等,。
在實際工作中，制備干擾素多采用兩種方法,。一是用干擾素誘生劑誘導某些生物細胞產(chǎn)生干擾素,，經(jīng)提取純化并檢定合格后即可使用。該法所用的細胞多為外周血白細胞,。二是采用基因工程法進行生產(chǎn),，即將干擾素基因?qū)氪竽c桿菌內(nèi)，通過培養(yǎng)大腸桿菌來生產(chǎn)干擾素,。目前,，大規(guī)模生產(chǎn)干擾素主要采用基因工程法。
實驗設備
細胞培養(yǎng)設備(如培養(yǎng)瓶,、多孔培養(yǎng)板,、溫箱、顯微鏡,、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器等),、水浴箱等,。
實驗步驟
1. 制備誘生劑：采用NDVF系弱毒株，以雞胚尿囊液形式保存于-20℃,，
其血凝滴度穩(wěn)定在1:640～1:1 280之間,。大量繁殖時，用0.5%水解乳蛋白稀釋100～1 000倍,，接種于9日齡雞胚尿囊腔,，置37℃培養(yǎng)72h后，收獲尿囊液,，效價測定應大于1:640,，無菌檢查應合格。
2. 制備誘生細胞：無菌采取人外周血(多用人臍帶血,，或血庫貯藏血),，置于含肝素的無菌瓶內(nèi)，于4℃保存不超過24h,，誘生細胞(白細胞)不單獨提取,，以全血代替,。
3. 制備粗制干擾素：
1) 加誘生劑,，按1ml抗凝全血加0.2ml誘生劑(即NDVF系尿囊液，其血凝滴度不低于1:640),；
2) 加溫吸附,，將加有誘生劑的抗凝全血置37℃水浴中1h，每隔15min晃動一次,，使NDVF吸附于白細胞上,。然后以1000r/min離心20min，棄上清,，留沉淀物,；
3) 加營養(yǎng)液孵育誘生，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle營養(yǎng)液于上述沉淀物中,，混勻,，置35～36℃溫箱內(nèi)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)18～20h；
4) 離心及酸處理,，將上述培養(yǎng)物以2000r/min離心30min,，取上清，以6mol/L鹽酸將其pH值調(diào)至2.0,，置4℃冰箱5天滅活NDV,；
5) 中性化，經(jīng)5天酸化后,，再用6mol/L氫氧化鈉將pH值調(diào)至7.2～7.4,，即為粗制干擾素,。
4. 制備精品干擾素：
1) KCNS沉淀，取上述粗制干擾素,，加KCNS并用2mol/L HCl調(diào)pH值為3.5,，然后以2 000r/min離心30min取沉淀；
2) 酒精提取,，將沉淀溶于95%酒精(預冷至-20℃),，用2mol/L NaOH調(diào)pH值為4.2，以2 000r/min離心30min取上清,；用2mol/L HCl調(diào)pH值至3.5,，離心后取上清，再將pH值調(diào)至5.6,，離心后取上清,，zui后將pH值調(diào)至7.1，離心后取沉淀,；
3) 過碘酸鈉沉淀,，將沉淀溶于PBS中，加過碘酸鈉,，并調(diào)pH值為4.5,，用50%乙醇10倍稀釋，離心后取上清,，將上清液對0.3mol/L (NH4)2CO3(pH值7.6)在4℃下透析過,。
4) sephacryl S200柱層析：將sephacryl S200按要求處理后裝柱(4～5×100cm柱)，用PBS平衡后,，加樣(即上述上清液),，用洗液洗脫。洗脫期間用核酸蛋白儀連續(xù)檢測,，收集相應峰即為精制干擾素,。取樣進行效價測定，按結(jié)果進行稀釋,，分裝并凍干,。
5. 檢定
1) 效價測定
a. 制備攻擊病毒：將水泡性口炎病毒(VSV)在雞胚成纖維母細胞上傳代后，
再在豬細胞(IBRS)上傳3～5代,，使其對IBRS有良好致病效應,，其TCID50應穩(wěn)定(一般在10-6～10-7之間)。
b. 準備測定細胞：生長良好的幼齡IBRS單層細胞,。
c. 測定：取上述單層細胞分為若干組,，每組加不同稀釋度的干擾素，置37℃孵育20～24h，然后每管均用100個TCID50的VSV攻擊,，置37℃ 48～72h孵育后,，觀察結(jié)果。同時設細胞對照組和病毒對照組,。病毒對照組CPE＞75%,，正常細胞對照組CPE=0，即認為該測定系統(tǒng)有效,。干擾素判定標準是以能保護半數(shù)細胞免受攻擊病毒損害的干擾素zui高稀釋度的倒數(shù)作為干擾素的單位,。
2) 酸堿度測定
取本品10支，加水溶解,，精密測量pH值應為6.0～7.5,。
3) 水分測定
按磺硫溶液法測定，不得超過3%,。
4) 安全試驗
取本品加水溶解,，小鼠尾靜脈注射，48h內(nèi)不得有死亡,。
5) 熱原檢查
取本品1支,，加水溶解，依法檢查,，應符合規(guī)定,。
6) 菌檢
取本品3支，無菌水溶解,，分別接種到檢查需氧菌,、厭氧菌及霉菌用培養(yǎng)基上,，37℃培養(yǎng)1周,，應無菌生長。
7) 超敏反應
取健康豚鼠6只,，每只腹腔注射本品適量,，連續(xù)3次，于20天后再于耳靜泳注入本品適量,，應無過敏反應現(xiàn)象發(fā)生,。
注意事項
1. 制備NDVF系弱毒誘生劑時，種毒應無菌檢查合格,，且滴度在1:640以上,。收毒時，應將污染的雞胚棄去,。
2. 不必從血液中將白細胞提取出來,，因紅細胞對白細胞產(chǎn)生干擾素有營養(yǎng)作用。純化的白細胞產(chǎn)生干擾素效價不一定高。
3. 酸化的目的是殺死其中的誘生劑NDV,，而在pH值20時,，干擾素是穩(wěn)定的。
4. 在常溫下干擾素半衰期很短,。故各種操作要在低溫環(huán)境下進行,，動作要迅速，純化所用試劑要作預冷處理,。干擾素粗品及精品要及時置低溫下存放,。效價測定時，干擾素應于臨用時現(xiàn)溶解,。
