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實(shí)驗(yàn)原理
干抗素是干擾素誘生劑作用于有關(guān)生物細(xì)胞所產(chǎn)生的一類高活性,、多功能蛋白質(zhì)。它從細(xì)胞產(chǎn)生和釋放出來以后,，又作用于相應(yīng)的其它同種細(xì)胞,，使其獲得抗病毒及抗腫瘤等多方面的免疫力。
所謂干擾素誘生劑,，是指能誘導(dǎo)有關(guān)生物細(xì)胞產(chǎn)生干擾素的一類物質(zhì),。能誘導(dǎo)有關(guān)生物細(xì)胞產(chǎn)生α和β干擾素者稱甲類干擾素誘生劑，如各種動(dòng)物病毒,、細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物等,；可誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素的稱為乙類干擾素誘生劑，如脂多糖,、鏈球菌毒素,、腸毒素A等。
在實(shí)際工作中,，制備干擾素多采用兩種方法。一是用干擾素誘生劑誘導(dǎo)某些生物細(xì)胞產(chǎn)生干擾素,，經(jīng)提取純化并檢定合格后即可使用,。該法所用的細(xì)胞多為外周血白細(xì)胞。二是采用基因工程法進(jìn)行生產(chǎn),，即將干擾素基因?qū)氪竽c桿菌內(nèi),，通過培養(yǎng)大腸桿菌來生產(chǎn)干擾素,。目前，大規(guī)模生產(chǎn)干擾素主要采用基因工程法,。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(如培養(yǎng)瓶,、多孔培養(yǎng)板、溫箱,、顯微鏡,、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器等)、水浴箱等,。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 制備誘生劑：采用NDVF系弱毒株,，以雞胚尿囊液形式保存于-20℃，
其血凝滴度穩(wěn)定在1:640～1:1 280之間,。大量繁殖時(shí),，用0.5%水解乳蛋白稀釋100～1 000倍，接種于9日齡雞胚尿囊腔,，置37℃培養(yǎng)72h后,，收獲尿囊液，效價(jià)測(cè)定應(yīng)大于1:640,，無菌檢查應(yīng)合格,。
2. 制備誘生細(xì)胞：無菌采取人外周血(多用人臍帶血，或血庫貯藏血),，置于含肝素的無菌瓶內(nèi),，于4℃保存不超過24h，誘生細(xì)胞(白細(xì)胞)不單獨(dú)提取,，以全血代替,。
3. 制備粗制干擾素：
1) 加誘生劑，按1ml抗凝全血加0.2ml誘生劑(即NDVF系尿囊液,，其血凝滴度不低于1:640),；
2) 加溫吸附，將加有誘生劑的抗凝全血置37℃水浴中1h,，每隔15min晃動(dòng)一次,，使NDVF吸附于白細(xì)胞上。然后以1000r/min離心20min,，棄上清,，留沉淀物；
3) 加營養(yǎng)液孵育誘生,，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle營養(yǎng)液于上述沉淀物中,，混勻，置35～36℃溫箱內(nèi)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)18～20h,；
4) 離心及酸處理,，將上述培養(yǎng)物以2000r/min離心30min,，取上清，以6mol/L鹽酸將其pH值調(diào)至2.0,，置4℃冰箱5天滅活NDV,；
5) 中性化，經(jīng)5天酸化后,，再用6mol/L氫氧化鈉將pH值調(diào)至7.2～7.4,，即為粗制干擾素。
4. 制備精品干擾素：
1) KCNS沉淀,，取上述粗制干擾素,，加KCNS并用2mol/L HCl調(diào)pH值為3.5，然后以2 000r/min離心30min取沉淀,；
2) 酒精提取,，將沉淀溶于95%酒精(預(yù)冷至-20℃)，用2mol/L NaOH調(diào)pH值為4.2,，以2 000r/min離心30min取上清,；用2mol/L HCl調(diào)pH值至3.5，離心后取上清,，再將pH值調(diào)至5.6,，離心后取上清，zui后將pH值調(diào)至7.1,，離心后取沉淀,；
3) 過碘酸鈉沉淀，將沉淀溶于PBS中,，加過碘酸鈉,，并調(diào)pH值為4.5，用50%乙醇10倍稀釋,，離心后取上清,，將上清液對(duì)0.3mol/L (NH4)2CO3(pH值7.6)在4℃下透析過。
4) sephacryl S200柱層析：將sephacryl S200按要求處理后裝柱(4～5×100cm柱),，用PBS平衡后,，加樣(即上述上清液)，用洗液洗脫,。洗脫期間用核酸蛋白儀連續(xù)檢測(cè),，收集相應(yīng)峰即為精制干擾素。取樣進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,，按結(jié)果進(jìn)行稀釋,，分裝并凍干。
5. 檢定
1) 效價(jià)測(cè)定
a. 制備攻擊病毒：將水泡性口炎病毒(VSV)在雞胚成纖維母細(xì)胞上傳代后,，
再在豬細(xì)胞(IBRS)上傳3～5代,，使其對(duì)IBRS有良好致病效應(yīng)，其TCID50應(yīng)穩(wěn)定(一般在10-6～10-7之間),。
b. 準(zhǔn)備測(cè)定細(xì)胞：生長良好的幼齡IBRS單層細(xì)胞,。
c. 測(cè)定：取上述單層細(xì)胞分為若干組，每組加不同稀釋度的干擾素,，置37℃孵育20～24h,，然后每管均用100個(gè)TCID50的VSV攻擊，置37℃ 48～72h孵育后,，觀察結(jié)果,。同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。病毒對(duì)照組CPE＞75%,，正常細(xì)胞對(duì)照組CPE=0,，即認(rèn)為該測(cè)定系統(tǒng)有效。干擾素判定標(biāo)準(zhǔn)是以能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受攻擊病毒損害的干擾素zui高稀釋度的倒數(shù)作為干擾素的單位,。
2) 酸堿度測(cè)定
取本品10支,，加水溶解，精密測(cè)量pH值應(yīng)為6.0～7.5,。
3) 水分測(cè)定
按磺硫溶液法測(cè)定,，不得超過3%。
4) 安全試驗(yàn)
取本品加水溶解,，小鼠尾靜脈注射,，48h內(nèi)不得有死亡。
5) 熱原檢查
取本品1支,，加水溶解,，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定,。
6) 菌檢
取本品3支,，無菌水溶解，分別接種到檢查需氧菌,、厭氧菌及霉菌用培養(yǎng)基上,，37℃培養(yǎng)1周，應(yīng)無菌生長,。
7) 超敏反應(yīng)
取健康豚鼠6只,，每只腹腔注射本品適量，連續(xù)3次,，于20天后再于耳靜泳注入本品適量,，應(yīng)無過敏反應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生。
注意事項(xiàng)
1. 制備NDVF系弱毒誘生劑時(shí),，種毒應(yīng)無菌檢查合格,，且滴度在1:640以上,。收毒時(shí)，應(yīng)將污染的雞胚棄去,。
2. 不必從血液中將白細(xì)胞提取出來,，因紅細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素有營養(yǎng)作用。純化的白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素效價(jià)不一定高,。
3. 酸化的目的是殺死其中的誘生劑NDV,，而在pH值20時(shí)，干擾素是穩(wěn)定的,。
4. 在常溫下干擾素半衰期很短,。故各種操作要在低溫環(huán)境下進(jìn)行，動(dòng)作要迅速,，純化所用試劑要作預(yù)冷處理,。干擾素粗品及精品要及時(shí)置低溫下存放。效價(jià)測(cè)定時(shí),，干擾素應(yīng)于臨用時(shí)現(xiàn)溶解,。
