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實(shí)驗原理
經(jīng)過抗體測定的陽性孔,，可以擴(kuò)大培養(yǎng),，進(jìn)行克隆,，以得到單個細(xì)胞的后代分泌單克隆抗體,?？寺〉臅r間一般說來越早越好,。因為在這個時期各種雜交瘤細(xì)胞同時旺盛生長，互相爭奪營養(yǎng)和空間,，而產(chǎn)生抗體的細(xì)胞有被淹沒和淘汰的可能,。但克隆時間也不宜太早，太早細(xì)胞性狀不穩(wěn)定,，數(shù)量少也易丟失,。
克隆化的陽性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過一段時期培養(yǎng)之后,，也還會因為細(xì)胞突變或特定染色體的丟失,，使部分細(xì)胞喪失產(chǎn)生抗體的能力，所以需要再次或多次克隆化培養(yǎng),?？寺』螖?shù)的多少由分泌能力強(qiáng)弱和抗原的免疫性強(qiáng)弱而決定。一般說,，免疫性強(qiáng)的抗原克隆次數(shù)可少一些,，但至少要3～5次克隆才能穩(wěn)定,。
實(shí)驗步驟
1. 有限稀釋法
1) 材料
a. 微量培養(yǎng)盤，盤內(nèi)各孔于克隆化前一天培養(yǎng)小鼠腹腔細(xì)胞(即飼養(yǎng)細(xì)胞)每孔2萬～4萬,。
b. HT培養(yǎng)基
2) 操作方法
a. 取出抗體陽性孔細(xì)胞,，用HT培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。并取樣進(jìn)行臺盼蘭染色,，計數(shù),。
b. 用HT培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成200個/ml、40個/ml,、20個/ml和的懸液,。
c. 用吸管將細(xì)胞懸液分別種入微量培養(yǎng)盤，每孔0.05ml,，細(xì)胞含量分別為10個/孔,、2個/孔、1個/孔和0.5個/孔,。
d. 5％CO2飽和濕度,，37℃培養(yǎng)。
e. 每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況,，選擇只有一個集落生長的孔,，棄掉兩個以上和沒有細(xì)胞生長的孔。
f. 克隆大量繁殖后,，布滿孔底的1/3～1/2時,，測培養(yǎng)液抗體。
g. 抗體陽性孔細(xì)胞,，移到有飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)瓶中,，并傳2～4代就可以脫離飼養(yǎng)細(xì)胞，建成克隆株,。
2. 軟瓊脂克隆化
借助撒在軟瓊脂上單個細(xì)胞定位生長,，而達(dá)到克隆化，具體操作如下：
1) 配2.5％的瓊脂糖30ml,，水浴溶化后,，移入45℃水浴中。
2) 將117ml*DMEM液和3ml 10倍濃度的DMEM液混合,，置45℃水浴預(yù)熱,。
3) 將瓊脂糖與DMEM液混合，即為含0.5％瓊脂糖的*DMEM液,，并加75×108 脾細(xì)胞,。
4) 每塊平皿加10ml，于室溫中凝固,。
5) DMEM中的細(xì)胞與DMEM—瓊脂1:1混合,，將細(xì)胞瓊脂混合物2ml鋪于凝固的平板上,，使其全部覆蓋。
6) 放入CO2箱飽和濕度,，37℃培養(yǎng)10天,。
7) 用PBS配制0.6％瓊脂糖，于沸水浴溶解后,，置45℃，在保溫情況下取一試管,，迅速加入0.1ml 25％羊紅血球,，0.2ml豚鼠補(bǔ)體，2.7ml 0.6％瓊脂糖,。
8) 用3ml瓊脂糖—羊紅血球混合液覆蓋克隆,。于37℃CO2箱孵育1h~2h。從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍,，可篩選抗羊紅血球Ig,。
3. 顯微鏡操作法
在直徑6cm培養(yǎng)皿中，加入1ml 1.0×108細(xì)胞懸液放置5％CO2飽和濕度,，37℃溫箱中放置30min以上,，倒置顯微鏡下，尋找那些與周圍相距甚遠(yuǎn)的單個細(xì)胞,，將毛細(xì)管口(一頭有直角彎頭毛細(xì)管,，一頭連接一尺長乳膠管，用口控制液體進(jìn)入)水平置放于液面上,，左右微動,，直到看見管口，對準(zhǔn)細(xì)胞,，吸入毛細(xì)管,，將管中細(xì)胞移到預(yù)先加有2.0×104~5.0×104飼養(yǎng)細(xì)胞96孔板內(nèi)，培養(yǎng)后,，即可獲得單個細(xì)胞形成的克隆,。
4. 熒光激活分離法
用一種熒光激活細(xì)胞分類器(Fluorescein Activafed Cell Sorter，F(xiàn)ACS),。其基本原理是：將細(xì)胞經(jīng)熒光抗體染色后,，經(jīng)噴嘴形成單個細(xì)胞的線形液滴，在萊塞光激發(fā)下,，熒光素發(fā)射熒光,，此信號由光電倍增管接收，再結(jié)合細(xì)胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號,，經(jīng)電腦處理,，產(chǎn)生信號并與預(yù)定的信號對比,，根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度及細(xì)胞大小不同，將細(xì)胞分成不同級別,，在電場中發(fā)生偏離,，而分別收集于不同容器中。
