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實(shí)驗(yàn)步驟

一,、抗原的提取

　　抗原的制備是一件十分細(xì)致的工作,，要制備一個(gè)高純度的抗原,，需要付出艱巨的努力,，制備工作涉及物理學(xué),、化學(xué)和生理學(xué)等許多領(lǐng)域的知識(shí),。根據(jù)物理或化學(xué)特性建立起來(lái)的分離、純化方法的主要原理不外乎科二個(gè)方面：①利用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別將他們分配到可用機(jī)械方法分離的兩或幾個(gè)物相中,，如鹽析,、有機(jī)溶劑抽提、層析和結(jié)晶等,；②把混合物置于單一物相中,，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于不同的區(qū)域而達(dá)到分離的目的，如電泳,、超速離心和超濾等,。由于組織細(xì)胞內(nèi)存著許多分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的抗原物質(zhì)，其分離方法也不一樣,，就是同一類大分子物質(zhì),，因選材不同，所使用的方法也很大差別,。因此很難有一個(gè)通用的標(biāo)準(zhǔn)方法供提取任何生物活性物質(zhì)使用,，所以在提取前必須針對(duì)所欲提取的物質(zhì)，充分查閱文獻(xiàn)資料,，選用合適的方法,。如果要提取一個(gè)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)未知的抗原物質(zhì),，更需要經(jīng)過(guò)各種方法的比較探索，才能找到一些工作規(guī)律和獲得預(yù)期的效果,。

　　抗原物質(zhì)的制備,，大概要經(jīng)過(guò)如下過(guò)程：①材料的選擇和預(yù)處理；②細(xì)胞的粉碎（細(xì)胞器的分離）,。③提?。虎芗兓?；⑤濃縮或干燥,，保存。現(xiàn)分別簡(jiǎn)述如下,。

　?。ㄒ唬┎牧系倪x擇及預(yù)處理

　　選擇什么材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩āＭǔ＿x含量高,、工藝簡(jiǎn)便,、成本低的材料。材料選定后,，通常要進(jìn)行預(yù)處理,，剔除結(jié)締組織、脂肪組織等,，把組織塊剪碎,。若取材后不立即進(jìn)行提取，則應(yīng)冷凍保存,，動(dòng)物組織更要深低溫保存,。某些容易失活的物質(zhì)，一般宜采用新鮮材料,。

　?。ǘ┘?xì)胞的粉碎

　　除了提取體液、組織間液內(nèi)的多肽,、蛋白質(zhì),、酶不需粉碎細(xì)胞外，凡要提取組織內(nèi),、細(xì)胞膜上及胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)，都必須把組織和細(xì)胞粉碎,，使活性物質(zhì)充分釋放到溶液內(nèi),。不同的組織，細(xì)胞的破碎難易不一,，因此所使用的粉碎方法也不*相同,。如腦,、胰、肝等比較軟嫩的組織,，用普通勻漿器研磨就行,，肌肉、心臟等則需絞碎后再作勻漿?，F(xiàn)漿常用的細(xì)胞粉碎方法介紹如后,。

　　1．物理法

　　（1）高速組織搗碎機(jī)：通常由調(diào)速器,、支架,、馬達(dá)、帶桿刀葉,、有機(jī)玻璃筒等組成,。把材料放于筒內(nèi)（約占筒內(nèi)容積的1/3）固定筒蓋，開動(dòng)馬達(dá),，調(diào)速器由慢逐漸增至所需速度,。此法適用于內(nèi)臟組織。

　?。?）玻璃勻漿器：由一個(gè)內(nèi)壁經(jīng)過(guò)磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（球面經(jīng)過(guò)磨砂）玻璃研桿組成,。把絞碎的組織置于管內(nèi)，加適量溶液,，插入研桿,，用手或電動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)研桿，并上下移動(dòng),。用此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)高,，對(duì)大分子的破壞也少。是粉碎少量軟嫩材料（腦,、胰,、肝等）時(shí)常用的方法。

　?。?）超聲波處理法：多用于軟嫩組織,，根據(jù)不同組織采用不同頻率，處理10～15min,，超聲波處理時(shí)溶液溫度升高,，使不耐熱的物質(zhì)失活，使用時(shí)為防止溫度升高,，除間歇開機(jī)外,，還需人工降溫，避免溶液內(nèi)存在氣泡,。核酸及某些酶對(duì)超聲波很敏感,，要慎用,。

　　（4）反復(fù)凍融法：把待碎樣品冷卻到零下15～20,。C,，凍固后取出，緩慢解凍,，如此反復(fù)操作,，可使大部分動(dòng)物性細(xì)胞及胞內(nèi)的顆粒破碎，但也可使生物活性物質(zhì)失活,。

　?。?）冷熱交替法：把材料投入90。C左右水中維持?jǐn)?shù)分鐘后取出投入冰浴內(nèi),，可使大部分細(xì)胞破碎,。可用于提取蛋白質(zhì)和核酸,。

　　2．化學(xué)和生物化學(xué)法

　?。?）自溶法：把新鮮材料置于一定的pH和適宜的溫度下，利用組織細(xì)胞自身的酶系統(tǒng)把組織破壞,，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái),。動(dòng)物材料的自溶溫度選在0～4℃，需加少量防腐劑,，自溶時(shí)間較長(zhǎng),，不易控制，不常用,。

　?。?）溶菌酶處理法：多用于破壞大腸桿菌等微生物的細(xì)胞壁。在每毫升含2億個(gè)細(xì)胞的懸液中加100μg至1mg溶菌酶,，37℃,，保溫10min，細(xì)胞就破壞了,。此外,，蝸牛酶、纖維素酶也被選作破碎細(xì)菌細(xì)胞之用,。

　?。?）表面活性劑處理法：較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶,、去氧膽酸鈉等,。

　　（三）抗原的提取

　　提取,、抽提,、萃取這3個(gè)詞的含義基本相同。但一般說(shuō)來(lái),，提取是指在分離純化前期,，將經(jīng)過(guò)處理或粉碎了的細(xì)胞置于一定條件和溶劑中，讓被提取物充分地釋放出來(lái)的過(guò)程,，而抽提則是貫穿于分離純化的整個(gè)過(guò)程中,，如在制備核酸過(guò)程中，用氯仿反復(fù)提取蛋白液,，用苯酚反復(fù)抽提分離DNA和RNA,。影響提取的因素主要來(lái)自被提取物在提取的溶劑中的溶解度大小以及它由固相擴(kuò)散到液相的難易。一個(gè)物質(zhì)在某一溶劑中的溶解度大小和該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及使用的溶劑的理化性質(zhì)有關(guān),。一般說(shuō)來(lái),，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性大分子的等電點(diǎn)遠(yuǎn)的pH值使溶解度增加,。因此,，在不同的抗原提取過(guò)程中，所選用的溶劑的性質(zhì),、pH值,、離子強(qiáng)度、抽提溫度,、介電常數(shù)等因素是提取成敗的重要因素,。要達(dá)到分離提純的目的，必須靈活地應(yīng)用這些因素,。